張永剛，王 政，張凱璇，邢麗紅，吳 薇，李 靖，武寧寧，宋以柱，劉 瑩

(1.中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266100；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；3.青島市海洋發(fā)展促進(jìn)中心，山東青島 266071；4.青島市海洋管理保障中心，山東青島 266071；5.青島市漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東青島 266071)

由于環(huán)境中多種抗生素低劑量、長(zhǎng)時(shí)間混合暴露的特點(diǎn)，單一抗生素的生物學(xué)效應(yīng)研究顯然不能滿足對(duì)抗生素生態(tài)毒理效應(yīng)的正確全面評(píng)估，因此對(duì)抗生素進(jìn)行聯(lián)合毒性研究勢(shì)在必行。目前，關(guān)于恩諾沙星和氟苯尼考對(duì)甲殼類動(dòng)物、海洋細(xì)菌、輪蟲、海洋硅藻和魚類的毒性，恩諾沙星與磺胺二甲嘧啶的聯(lián)合毒性已有報(bào)道，但關(guān)于恩諾沙星和氟苯尼考的聯(lián)合毒性，及對(duì)兩棲動(dòng)物(中華鱉)聯(lián)合暴露造成的毒性研究較少。本研究使用恩諾沙星與氟苯尼考配制成抗菌劑混合物，對(duì)中華鱉進(jìn)行了低、中、高濃度(相當(dāng)于每種藥物正常臨床劑量的1、3、5 倍)的毒理學(xué)研究，以期為抗菌劑混合物在中華鱉病害防控及獸醫(yī)臨床中的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中華鱉由山東省平度百歲泊中華鱉養(yǎng)殖基地提供，體質(zhì)量為(500±50)克/只。實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行物理和生化檢查，以確保所有實(shí)驗(yàn)鱉無病無傷，體內(nèi)無恩諾沙星和氟苯尼考藥物殘留，于給藥前停飼24小時(shí)。

2.藥品與試劑 恩諾沙星原料粉(純度≥98%，CAS：MFCD00792463)購自上海麥克林生化科技有限公司，氟苯尼考原料粉(純度≥99%，CAS：73231-34-2)購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司，無水乙醇、甲醛、冰乙酸、二甲苯均為分析純。

3.藥物配制 參考2015年版《中國獸藥典》《新編漁藥手冊(cè)》和《恩諾沙星水產(chǎn)養(yǎng)殖使用規(guī)范》(SC/T 1084-2007)用藥標(biāo)準(zhǔn)，氟苯尼考與恩諾沙星對(duì)魚的日推薦用藥劑量均為15 毫克/千克，因兩種藥物聯(lián)合使用，故每種藥物用量減半。使用0.9%生理鹽水將氟苯尼考原料粉與恩諾沙星原料粉分別配制成濃度為15、45、75毫克/毫升的藥液，即魚推薦劑量的1倍劑量(恩諾沙星7.5毫克/千克＋氟苯尼考7.5毫克/千克)、3倍劑量(恩諾沙星22.5 毫克/千克＋氟苯尼考22.5 毫克/千克)和5 倍劑量(恩諾沙星37.5 毫克/千克＋氟苯尼考37.5毫克/千克)(體質(zhì)量計(jì))。

4.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(1倍、3倍及5倍劑量組)和1個(gè)對(duì)照組，均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行實(shí)驗(yàn)鱉10 只。參照劉瑩等(2022)的方法，實(shí)驗(yàn)組采用口灌給藥方式，用帶有橡皮軟管的注射器從中華鱉口中插入，灌喂抗菌劑混合物(恩諾沙星和氟苯尼考)藥液0.5 毫升。對(duì)照組口灌等量的無菌生理鹽水溶液。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 天，口灌1 次/天，實(shí)驗(yàn)期間水溫為25～26℃。

5.樣品采集與組織切片處理 參照劉瑩等(2022)的方法，于停藥24 小時(shí)后，在對(duì)照組和口灌不同劑量抗菌劑混合物實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取3只中華鱉于冰盤上進(jìn)行解剖，采集肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、腸道、睪丸和精巢組織樣本。參考張永剛(2019)的方法，對(duì)所有組織進(jìn)行固定、切片、染色后，在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)分析。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.腸道組織結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，黏膜細(xì)胞類型正常，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整(圖1-腸道A)。與對(duì)照組相比，1 倍劑量組腸絨毛出現(xiàn)孔隙，結(jié)構(gòu)不完整(圖1-腸道B)。隨著口灌劑量的增加，3倍劑量組腸固有層結(jié)構(gòu)皺縮，腸絨毛排列不整齊，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，細(xì)胞核H.E.染色加深(圖1-腸道C)；5倍劑量組黏膜層相融，結(jié)構(gòu)模糊，固有層、中央乳糜管消失，腸腔內(nèi)可見大量脫落的腸黏膜(圖1-腸道D)。

2.肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組肝細(xì)胞排列緊密，肝小葉、中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常(圖1-肝臟A)。與對(duì)照組相比，1倍劑量組肝靜脈血管壁增厚，中央靜脈出現(xiàn)炎性細(xì)胞(圖1-肝臟B)。隨著口灌劑量的增加，3倍劑量組可見肝血竇擴(kuò)張，有大量血細(xì)胞浸潤(圖1-肝臟C)；5 倍劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，肝靜脈血管壁繼續(xù)膨脹，血竇繼續(xù)擴(kuò)張，竇壁破碎細(xì)胞散布于其中(圖1-肝臟D)。

3.腎臟組織結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組腎小球和腎小管清晰，腎小管排列整齊，腎細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰(圖1-腎臟A)。與對(duì)照組相比，1 倍劑量組腎細(xì)胞間有大量血鐵紅素沉積，腎小球開始萎縮變形(圖1-腎臟B)。隨著口灌劑量的增加，3倍劑量組腎被膜內(nèi)層平滑肌下有較多炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞松散，H.E.染色逐漸變淺(圖1-腎臟C)；5倍劑量組腎細(xì)胞出現(xiàn)裂解現(xiàn)象，腎小管結(jié)構(gòu)模糊甚至完全消失，細(xì)胞H.E.染色變淺(圖1-腎臟D)。

4.脾臟組織結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組脾組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯，排列緊密(圖1-脾臟A)。與對(duì)照組相比，1 倍劑量組橢圓體鞘室內(nèi)有紅細(xì)胞浸潤(圖1-脾臟B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組脾組織細(xì)胞松散，細(xì)胞略微空泡化，胞核固縮，H.E.染色加深，中央動(dòng)脈內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(圖1-脾臟C、D)。

5.睪丸組織結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組觀察到曲細(xì)精管邊界線明顯，結(jié)構(gòu)完好無損，其內(nèi)充斥著大量的生精細(xì)胞(圖1-睪丸A)。與對(duì)照組相比，1 倍劑量組曲細(xì)精管內(nèi)精子細(xì)胞開始減少(圖1-睪丸B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組睪丸實(shí)質(zhì)內(nèi)成熟精子細(xì)胞顯著減少，結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)空腔現(xiàn)象(圖1-睪丸C、D)。

6.精巢組織切片觀察 對(duì)照組精巢曲細(xì)精管腔結(jié)構(gòu)清晰，精小囊內(nèi)充斥著大量生殖細(xì)胞群體(圖1-精巢A)。與對(duì)照組相比，1 倍劑量組精小囊內(nèi)生殖細(xì)胞逐漸減少(圖1-精巢B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組精巢組織受損嚴(yán)重，曲細(xì)精管腔壁腫脹，生精小管內(nèi)成熟精子細(xì)胞嚴(yán)重減少，導(dǎo)致空腔現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1-精巢C、D)。

7.心臟組織結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組心肌膜結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維縱橫交叉，排列有序(圖1-心臟A)。與對(duì)照組相比，1倍劑量組胞核固縮、脫落，心肌纖維間浸潤大量的炎性細(xì)胞(圖1-心臟A、B)。隨著口灌劑量的增加，3 倍和5 倍劑量組心肌纖維排列紊亂、斷裂，結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重(圖1-心臟C、D)。

8.肌肉組織切片觀察 對(duì)照組、1 倍和3 倍劑量組，從縱切面對(duì)肌肉組織觀察，肌細(xì)胞形態(tài)正常，肌纖維緊湊，平行排列(圖1-肌肉A、C)；與對(duì)照組相比，5倍劑量組肌纖維間隙增大，出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，肌細(xì)胞核固化，甚至消失(圖1-肌肉D)。

圖1 口灌抗菌劑混合物(恩諾沙星和氟苯尼考)對(duì)中華鱉組織的病理變化

三、討論

毒性數(shù)據(jù)是支持多種化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵。Ding 等(2022)將泥鰍鰭細(xì)胞暴露于400、800、1 200 微摩/升恩諾沙星中，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星抑制了細(xì)胞的增殖，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。Qiu等(2020)以斑馬魚為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻吩和四環(huán)素單一或聯(lián)合用藥對(duì)其早期發(fā)育和代謝系統(tǒng)有顯著影響，且得出聯(lián)合用藥具有協(xié)同毒性的結(jié)論。以上研究可以看出，當(dāng)特定藥物聯(lián)合使用時(shí)，可使毒性增加，并且會(huì)引起研究者對(duì)毒性的高度關(guān)注。

組織病理學(xué)提供了一個(gè)快速診斷，以檢測(cè)魚的各組織和器官在抗生素暴露后異常的方法。本實(shí)驗(yàn)探究了聯(lián)合用藥(恩諾沙星與氟苯尼考)對(duì)中華鱉的影響發(fā)現(xiàn)，高(5倍)、中(3倍)和低(1倍)劑量聯(lián)合給藥，均可造成中華鱉腸道、腎臟、肝臟、脾臟、睪丸和精巢等組織器官不同程度的病理損傷。損傷程度與劑量有關(guān)，5倍劑量組對(duì)各組織結(jié)構(gòu)影響最大。主要表現(xiàn)為腸黏膜層相融、結(jié)構(gòu)模糊，肝臟組織結(jié)構(gòu)松散、血竇擴(kuò)張，腎細(xì)胞裂解、腎小管消失，睪丸和精巢組織中成熟精子細(xì)胞顯著減少，出現(xiàn)空腔現(xiàn)象，脾組織細(xì)胞空泡化、胞核固縮，有炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列紊亂、斷裂，肌肉肌纖維溶解、細(xì)胞核消失。Gaikowski 等(2013)在羅非魚飼料中添加15、45、75 毫克/千克劑量的氟苯尼考(氟苯尼考推薦劑量的1、3、5 倍)，口服20 天后對(duì)組織觀察發(fā)現(xiàn)，肝臟中糖原型和脂質(zhì)型肝細(xì)胞空泡增加，淋巴細(xì)胞減少，腎小管上皮變性。Luan 等(2021)研究了恩諾沙星聯(lián)合黏菌素、喹烯酮對(duì)SPF 大鼠的短期毒性，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合口服14 天后，可造成嚴(yán)重的肝組織損傷。上述結(jié)果與本研究一致。腸道、肝臟、脾臟、腎臟作為動(dòng)物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，組織中包含多種非特異性免疫酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等，它們能夠防止活性氧自由基引起的重要細(xì)胞損傷。當(dāng)抗生素過量暴露或給藥后，刺激動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性活性氧自由基過度積累，例如超氧陰離子和過氧化氫，在不同組織中超出抗氧化能力來抵消，阻礙解毒反應(yīng)，隨后引起組織脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)DNA 或RNA 損傷，進(jìn)而增強(qiáng)抗生素對(duì)動(dòng)物機(jī)體組織器官的毒性。

心臟為動(dòng)物重要的循環(huán)系統(tǒng)器官，在血液循環(huán)和藥物運(yùn)輸方面起到重要的作用，抗生素對(duì)血液成分產(chǎn)生影響，進(jìn)而也會(huì)對(duì)心臟組織造成損傷。睪丸和精巢作為動(dòng)物重要的生殖器官，過量使用抗生素，殘留藥物能在組織中積累，進(jìn)而造成動(dòng)物遺傳毒性。氟喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的混合物可以通過改變轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平來引起斑馬魚幼體的免疫毒性和心臟損傷(Li 等，2016；Yin 等，2014)。以前對(duì)大鼠和狗的研究顯示，多次口服氟苯尼考后會(huì)使血液參數(shù)發(fā)生變化，肝體指數(shù)增加和睪丸萎縮(歐洲藥品管理局)。在本研究中也顯示出相同的毒性。一般來說，養(yǎng)殖魚大量口服抗生素后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧自由基，導(dǎo)致染色體破裂、異常，破壞DNA 修復(fù)蛋白質(zhì)的功能，從而誘發(fā)遺傳毒性和細(xì)胞凋亡。

四、小結(jié)

本研究表明，恩諾沙星和氟苯尼考聯(lián)用可使毒性增加，對(duì)中華鱉的各個(gè)組織器官均可造成嚴(yán)重的損傷，且聯(lián)合毒性具有劑量依賴性。高劑量的聯(lián)合毒性作用最強(qiáng)，毒性順序?yàn)椋荷称鞴伲九判蛊鞴伲鞠鞴伲久庖咂鞴伲狙h(huán)器官。因此，在實(shí)際養(yǎng)殖疾病治療時(shí)，必須合理規(guī)范使用抗菌藥物，不可盲目增加給藥劑量，以免對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)損失。