張舒蕾，張麗艷，李珍慧，安一鳴，高翔宇

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110034）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）屬于神經(jīng)退行性疾病，臨床上以認(rèn)知功能障礙、人格改變和學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行性減退為主要表現(xiàn)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)學(xué)說(shuō)眾多，如β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）級(jí)聯(lián)假說(shuō)、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）受損學(xué)說(shuō)、tau蛋白學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、膽堿能損傷學(xué)說(shuō)、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)假說(shuō)等［1］。目前Aβ級(jí)聯(lián)假說(shuō)占主導(dǎo)地位，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為Aβ在腦內(nèi)異常沉積是引起患者認(rèn)知功能障礙的主要原因。過(guò)多的Aβ引起神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的同時(shí)還會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，影響突觸功能，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等，這些反應(yīng)又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)Aβ在腦內(nèi)沉積，形成特殊的級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)［2］。

經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道3（transient receptor potential canonical 3，TRPC3）是瞬時(shí)受體電位家族中的一個(gè)亞型，廣泛表達(dá)于平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是腦海馬中。TRPC3主要通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的鈣離子水平，影響神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和突觸的控制［3］。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，AD模型中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可通過(guò)上調(diào)TRPC3表達(dá)，減輕腦海馬區(qū)的Aβ沉積，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，從而改善AD小鼠認(rèn)知功能。Aβ的清除主要有經(jīng)BBB轉(zhuǎn)運(yùn)出腦、細(xì)胞吞噬和Aβ降解酶降解3種途徑［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，正常生理狀況下腦間質(zhì)液中Aβ的濃度是血液中的6倍，通過(guò)BBB將Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)至有強(qiáng)大清除能力的外周血液，是其最主要、最快速的清除路徑。BBB對(duì)Aβ的高效轉(zhuǎn)運(yùn)性能主要與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在的Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)受體，如低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1）、P糖蛋白（permeability glycoprotein，P-gp）、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）等密切相關(guān)，同時(shí)還與血管壁完整性、配體親和力和競(jìng)爭(zhēng)力相關(guān)［7］。BBB功能障礙會(huì)影響Aβ的正常轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致Aβ沉積。同時(shí)，Aβ沉積會(huì)破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和緊密連接相關(guān)蛋白，導(dǎo)致BBB喪失完整性［8］。由此可見(jiàn)，BBB功能障礙和Aβ沉積可相互作用，共同促進(jìn)疾病進(jìn)展。本研究利用Aβ誘導(dǎo)AD小鼠模型，內(nèi)源性激活和抑制TRPC3，通過(guò)檢測(cè)小鼠的行為學(xué)改變、BBB通透性和功能變化、Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)受體LRP-1表達(dá)情況、腦組織和血清中Aβ濃度，探討TRPC3清除Aβ沉積的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：60只5周齡雄性費(fèi)城癌癥研究所小鼠（購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司），體質(zhì)量24～27 g，采用隨機(jī)分組原則，分為假手術(shù)組、模型組、二?；视皖?lèi)似物（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）組、吡唑化合物［ethyl-1-（4-（2，3，3-trichloroacrylamide）phenyl）-5-（trifluoromethyl）-1H-pyrazole-4-carboxylate，Pyr3］組，每組15只。腹腔注射3.5%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，模型組、OAG組和Pyr3組小鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42（410 pmol/3 μL），誘導(dǎo)AD小鼠模型，注射位置在腦中線向右1.1 mm、前囟后0.5 mm處，微量注射器注射深度3 mm，速度為0.6 μL/min，留針5 min。假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室注射等量滅菌生理鹽水。同天，OAG組和Pyr3組小鼠分別腹腔注射TRPC3的特異性激動(dòng)劑OAG（0.6 μg/g）和TRPC3的特異性抑制劑Pyr3（0.1 μg/g），1次/d，連續(xù)21 d，以上調(diào)和下調(diào)TRPC3的表達(dá)。

1.1.2 主要試劑：Aβ1-42（英國(guó)Abcam公司）；OAG、Pyr3（美國(guó)Cayman公司）；緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）抗體（美國(guó)Affinity公司）；鼠Aβ1-42蛋白抗體（英國(guó)Abcam公司）；LRP-1蛋白抗體、β-actin小鼠單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP（中國(guó)Boster生物公司）；伊文思藍(lán)（Evans blue，EB，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：造模后第16天開(kāi)始，持續(xù)6 d檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。圓形水池等距離分為4個(gè)象限，裝滿(mǎn)黑色墨水，水溫（25±1）℃。進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，在第3象限內(nèi)設(shè)置1個(gè)圓形平臺(tái)，隱藏在水位下約1 cm處，將小鼠面壁，于不同象限放入池內(nèi)，記錄小鼠上臺(tái)時(shí)間，最長(zhǎng)為60 s，若在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則用木棒引導(dǎo)至平臺(tái)上并停留5 s，3次/d。進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將平臺(tái)移走，記錄小鼠在60 s內(nèi)目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.2.2 EB染色測(cè)定BBB通透性：EB是一種經(jīng)典的BBB示蹤劑，可進(jìn)行BBB通透性的定量、定性測(cè)定［9］。小鼠尾靜脈注射2% EB（0.1 mL/10 g），2 h后染料在小鼠體內(nèi)充分循環(huán)，小鼠眼周、鼻唇、四肢等淺表皮膚呈藍(lán)色。水合氯醛麻醉小鼠，用肝素化生理鹽水心臟灌流，直到小鼠右心房流出清亮透明液體。取腦組織，稱(chēng)重后置于3 mL甲酰胺中，60 ℃恒溫水浴24 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液比色，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為620 nm的吸光度。根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腦組織EB含量。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)ZO-1蛋白表達(dá)：緊密連接受損時(shí)BBB通透性增加，ZO-1是目前公認(rèn)的檢測(cè)BBB通透性和功能的可靠指標(biāo)［10］。小鼠末次給藥2 h后取腦皮質(zhì)，切碎均漿，10 000 r/min離心10 min后取上清液，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。蛋白緩沖液水浴變性后取30 μL上樣于5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，室溫下垂直電泳2 h，轉(zhuǎn)膜2 h，在搖床上封閉PVDF膜2 h，4 ℃下與ZO-1抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)┓跤^(guò)夜。第2天再與HRP-羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)?、HRP-羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)┦覝叵路跤? h，ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)LRP-1蛋白表達(dá)：LRP-1主要表達(dá)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的腔外側(cè)，是Aβ的主要轉(zhuǎn)運(yùn)受體，介導(dǎo)Aβ由腦內(nèi)向血液流出過(guò)程［11］。取腦皮質(zhì)，蛋白濃度測(cè)定同上。制備聚丙烯酰胺凝膠后每孔上樣20 μL，室溫下垂直電泳2 h，轉(zhuǎn)膜2 h后浸入到5%（M/V）脫脂奶粉溶液中，搖床上封閉2 h，加入LRP-1抗體（1∶3 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。第2天室溫下與HRP-羊抗兔IgG（1∶2 000稀釋?zhuān)?、HRP-羊抗鼠IgG（1∶1 500稀釋?zhuān)┓跤? h，ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5 ELISA測(cè)定海馬和血清Aβ1-42濃度：小鼠末次給藥2 h后斷頭取血，分離血清。取腦海馬，勻漿，低溫超速（10 000 r/min）離心10 min后得上清液，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入標(biāo)準(zhǔn)品、海馬和血清稀釋樣品各100 μL，并加入HRP標(biāo)記的Aβ1-42檢測(cè)抗體4 ℃避光孵育過(guò)夜。第2天與TMB顯色試劑混合15 min，加入終止液，可見(jiàn)溶液顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色。酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品、樣本吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本的Aβ1-42濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)TRPC3對(duì)AD小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力有改善作用

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組第4天、第5天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.001）；與模型組比較，OAG組第4天、第5天逃避潛伏期明顯縮短（P＜ 0.05）；Pyr3組與模型組比較，第4天、第5天逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降（P＜ 0.001）；與模型組比較，OAG組目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜ 0.05）；Pyr3組與模型組比較，目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，AD造模成功，TRPC3激動(dòng)劑對(duì)AD小鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力有改善作用，TRPC3抑制劑對(duì)AD小鼠行為學(xué)無(wú)明顯作用。見(jiàn)表1。

表1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Morris water maze experimental results

2.2 上調(diào)TRPC3能恢復(fù)AD小鼠BBB通透性

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織EB含量增加（P＜ 0.05），BBB通透性增高；與模型組比較，OAG組腦組織EB含量減少（P＜ 0.05），BBB通透性下降；Pyr3組與模型組比較，腦組織EB含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，TRPC3激動(dòng)劑能恢復(fù)小鼠BBB通透性。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠EB含量、ZO-1和LRP-1蛋白表達(dá)水平、海馬和血清Aβ1-42濃度Tab.2 EB content，expression of ZO-1 and LRP-1 proteins，and Aβ1-42 concentration in the hippocampus and serum in each group

2.3 上調(diào)TRPC3能夠促進(jìn)BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組ZO-1表達(dá)下降（P＜0.01），表明BBB通透性增加、功能受損；與模型組比較，OAG組ZO-1表達(dá)增加（P＜ 0.05），表明受損的BBB通透性、功能有所恢復(fù)；Pyr3組與模型組比較，ZO-1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，TRPC3激動(dòng)劑能恢復(fù)BBB通透性，改善受損的BBB功能。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組小鼠ZO-1蛋白表達(dá)情況Fig.1 Zonula occluden-1 protein expression in each group determined by Western blotting

2.4 上調(diào)TRPC3能夠促進(jìn)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)受體LRP-1的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組LRP-1表達(dá)下降（P＜0.01）；與模型組比較，OAG組LRP-1表達(dá)增加（P＜0.05）；Pyr3組與模型組比較，LRP-1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，AD小鼠LRP-1表達(dá)下降，TRPC3激動(dòng)劑能促進(jìn)LRP-1的表達(dá)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 Western blotting檢測(cè)各組小鼠LRP-1蛋白表達(dá)情況Fig.2 Low density lipoprotein receptor-related protein-1 expression in each group determined by Western blotting

2.5 上調(diào)TRPC3可促進(jìn)腦組織的Aβ1-42向外周血轉(zhuǎn)運(yùn)

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬和血清的Aβ1-42濃度均升高（P＜ 0.01，P＜ 0.05）；與模型組比較，OAG組小鼠海馬Aβ1-42濃度下降（P＜ 0.05），血清Aβ1-42濃度升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，Pyr3組小鼠海馬Aβ1-42濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），血清Aβ1-42濃度下降（P＜ 0.01）。結(jié)果表明，上調(diào)TRPC3可減輕腦部Aβ1-42沉積，并促進(jìn)其向外周血轉(zhuǎn)運(yùn)。見(jiàn)表2。

3 討論

AD的病理特點(diǎn)為Aβ 在腦內(nèi)異常沉積形成老年斑，tau蛋白過(guò)度磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，海馬等腦區(qū)突觸和神經(jīng)元大量丟失等［12］。Aβ由淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生，若出現(xiàn)代謝障礙，Aβ會(huì)沉積于腦并產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。因此，找到減少腦部Aβ沉積的方法可能是治療AD的關(guān)鍵。Aβ是一種極性、可溶性大分子物質(zhì)，不能通過(guò)自由擴(kuò)散方式在腦組織和外周血中轉(zhuǎn)換。在Aβ的多種清除機(jī)制中，經(jīng)BBB轉(zhuǎn)運(yùn)出腦是最主要的方式。大量研究表明，Aβ主要通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)受體清除，如LRP-1、P-gp、RAGE等轉(zhuǎn)運(yùn)受體均高表達(dá)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，AD中LRP-1表達(dá)降低；若抑制健康小鼠LRP-1的腦內(nèi)表達(dá)，Aβ的外周轉(zhuǎn)運(yùn)率下降30%。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是BBB的重要組成成分，緊密連接使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成連續(xù)的單層物理屏障，使跨細(xì)胞自由擴(kuò)散受到抑制，同時(shí)還會(huì)調(diào)節(jié)離子、復(fù)合物在腦內(nèi)流動(dòng)。ZO-1是緊密連接蛋白中最主要的胞質(zhì)蛋白，在許多神經(jīng)功能障礙疾病中，ZO-1缺乏不僅直接影響緊密連接蛋白構(gòu)成，其水平降低還是BBB損傷的重要標(biāo)志。

本研究中，模型組EB含量增加，ZO-1、LRP-1表達(dá)下降，表明BBB受到破壞，BBB通透性增加，Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低，Aβ清除不力，海馬和血清的Aβ1-42濃度升高；而OAG組EB含量降低，ZO-1、LRP-1表達(dá)增加，表明在TPRC3激動(dòng)劑的作用下，受損的BBB功能得到改善，BBB通透性降低，Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)，海馬Aβ1-42濃度降低，Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)到周?chē)埽錋β1-42濃度升高。

本課題組前期研究［14］發(fā)現(xiàn)，激活TRPC3表達(dá)可減輕腦部Aβ沉積，從而改善AD小鼠認(rèn)知功能和突觸功能障礙。本研究證明，TRPC3的激活表達(dá)，可能通過(guò)修復(fù)LRP-1等Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，加速Aβ清除，從而改善小鼠的認(rèn)知功能。但尚不清楚TRPC3通過(guò)何種途徑修復(fù)BBB及LRP-1等Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)受體功能，需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

本研究中，給予TRPC3抑制劑后小鼠海馬Aβ1-42濃度改變不明顯。原因在于AD小鼠模型是通過(guò)側(cè)腦室注射高濃度Aβ造模，即使Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制，海馬Aβ濃度也不會(huì)有明顯改變。但肝臟、腎臟等臟器對(duì)已通過(guò)BBB的Aβ有強(qiáng)大的清除能力，所以給予TRPC3抑制劑后，小鼠血清Aβ1-42濃度相對(duì)下降。

綜上所述，本研究表明，激活TRPC3可恢復(fù)BBB功能，增加Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)受體LRP-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而清除腦組織Aβ沉積，改善AD行為學(xué)癥狀。