陳秀蘭，劉淑娟，蘇烏云，閆海成，竇佳，李志偉，王薇

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，呼和浩特 010107；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，呼和浩特 010051；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，呼和浩特 010051；4.內(nèi)蒙古鄂托克旗第二人民醫(yī)院急診科，內(nèi)蒙古 鄂托克旗 016064）

白蛋白結(jié)合型紫杉醇（albumin-bound paclitaxel，Nab-PTX）是一種新型的紫杉醇制劑，已被廣泛應(yīng)用于多種實體腫瘤的治療。該藥抗腫瘤作用很強，但有較重的神經(jīng)毒性，會引發(fā)周圍神經(jīng)病變（chemotherapy-induced neuropathic pain，CINP），患者常表述手足麻木和疼痛燒灼感，嚴(yán)重時可導(dǎo)致治療中斷。迄今為止，尚無有效的預(yù)防和治療方法。研究［1-2］表明，神經(jīng)系統(tǒng)的非神經(jīng)元成分可能參與了CINP的產(chǎn)生，這為該疾病治療的發(fā)展提供了新的靶點。

星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)先天免疫的主要細(xì)胞，通過表達(dá)的病原模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）感 知受損細(xì)胞釋放的病原體衍生物或內(nèi)源性配體，并啟動先天免疫反應(yīng)。Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）是第一個被識別的PRRs［3］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLR家族中被研究最多的成員，在脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加，可調(diào)節(jié)脊髓損傷或慢性疼痛誘導(dǎo)的中樞致敏的膠質(zhì)細(xì)胞活化和脊髓中炎癥介質(zhì)的釋放［4］。TLR4通過激活NF-κB通路來誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，參與痛覺過敏和異常性疼痛的形成［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的信號通路驅(qū)動神經(jīng)膠質(zhì)激活及炎癥反應(yīng)，但其在Nab-PTX引起CINP中的作用和機制尚不清楚，本研究旨在探究Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中TLR4/NF-κB信號通路、脊髓膠質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級成年雄性SD大鼠30只（300～350 g），購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。隨機分為Nab-PTX 4 mg/kg組、Nab-PTX 6 mg/kg組及對照組，每組10只。飼養(yǎng)條件：房間的溫度和濕度均為恒定（溫度20～26 ℃，濕度40%～70%），所有動物都在每日標(biāo)準(zhǔn)的光照7：00～19：00中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。所有動物實驗程序均按照國際疼痛研究協(xié)會的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并獲得動物護理和使用委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

1.2.1 實驗藥物及試劑：注射用Nab-PTX購自石藥集團歐意藥業(yè)有限公司（產(chǎn)品批號：B042003269）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司）；GFAP（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Iba-1、Rabbit Anti TLR4、Mouse Anti P65（美國萊恩生物科技有限公司）；山羊抗兔 IgG cy3（愛博泰克生物技術(shù)有限公司）；Trizon Reagent、超純RNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；Marker（賽默飛世爾科技公司）。

1.2.2 儀器：ZH-200熱刺痛儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；Von Frey纖毛機械刺激針（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；熒光PCR儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；蛋白垂直電泳儀、全自動酶標(biāo)儀（北京市六一儀器廠）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 一般情況觀測

觀察大鼠一般健康狀況，飲食、腹瀉、毛發(fā)，運動情況，測定體質(zhì)量變化。

1.4 構(gòu)建Nab-PTX化療后大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，參照YAMASHITA等［1］和SUN等［2］報道的Nab-PTX給藥劑量，Nab-PTX給藥組（Nab-PTX 6 mg/kg組和4 mg/kg組）分別于第1、8、15天腹腔注射給藥，連續(xù)給藥3次；對照組給予相同劑量的0.9%生理鹽水。分別于給藥前及給藥后不同時間點檢測各組大鼠體質(zhì)量，同時分別于第0、5、7、11、14、18、21、25、28、32、35天檢測各組大鼠機械縮足反射閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）及熱縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。行為學(xué)測定和藥物注射都在白天（9：00～17：00）進(jìn)行。

1.5 行為學(xué)測試

1.5.1 PWMT的測定：在安靜環(huán)境中適應(yīng)約30 min，將大鼠足底接觸于帶金屬網(wǎng)底的有機玻璃籠內(nèi)，按升序（1、2、4、6、8、10、15和26 g）逐漸增強的力度將校準(zhǔn)的 von Frey絲施加到左后足表面的中央皮膚5次，保持6～8 s，每次間隔15 s。當(dāng)后爪在連續(xù) 5 次應(yīng)用中有 4 次從特定長絲中迅速縮爪或舔足為陽性反應(yīng)，即為大鼠的PWMT［7］。

1.5.2 PWTL：采用熱刺痛儀照射光束穿過透明的玻璃板，光束直接照射大鼠的左后足，會引起迅速縮足或者舔腳等抬腳動作，記錄從光束照射開始到抬腳停止照射持續(xù)的時間，每側(cè)重復(fù)照射5次，每次照射間隔15 min，取平均數(shù)，即為大鼠的PWTL［8］。

1.6 組織取材

在實驗第1、8、15天腹腔注射Nab-PTX，于第21天檢測到大鼠PWMT最低值，故于第21天將大鼠處死，取各組大鼠脊髓腰膨大處組織。

1.7 檢測方法

1.7.1 ELISA 檢測：采用雙抗體夾心法，分光光度計讀數(shù)均使用酶標(biāo)儀進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)曲線計算脊髓組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。所有實驗重復(fù) 3 次。

1.7.2 免疫熒光檢測：取出大鼠脊髓組織，培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗GFAP、Iba-1，4 ℃ 冰箱孵育過夜，次日用PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗CY3（1∶200），濕盒中37 ℃孵育30 min，PBS浸洗切片3次，每次5 min；最后滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS沖洗多余的DAPI，自來水沖洗1 min。吸水紙吸干玻片上的液體，含抗熒光淬滅劑的封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7.3 實時PCR檢測：取出大鼠脊髓組織，使用TRIzol Reagent，提取RNA且測定濃度后，逆轉(zhuǎn)錄得到mRNA，再測定相對表達(dá)量，后進(jìn)行實時PCR，反應(yīng)體系如 下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL；上游引物0.4 μL；下游引物0.4 μL；cDNA 1 μL；補充RNase Free dH2O 8.2 μL，反應(yīng)總體積為20 μL，擴增條件：95 ℃變性10 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共需要40個循環(huán)。內(nèi)參為β-actin，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。其中Stem-loop primer為引物設(shè)計時一起合成，見表1。

表1 相關(guān)引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7.4 Western blotting檢測：取出大鼠脊髓組織，剪取樣品置于離心管內(nèi)，加入RIPA細(xì)胞裂解液勻漿。高速離心機12 000 r/min 離心10 min。取上清液至新的EP管（BCA測定），棄沉淀。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，配置SDS-PAGE膠，行蛋白電泳，后用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。用PVDF膜孵育一抗過夜，次日PVDF膜室溫孵育二抗2 h，洗膜，顯影成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)的分析采用重復(fù)測量方差分析（Repeated-Measure ANOVA），同一時間點組間比較采用Bonferroni檢驗；ELISA、免疫熒光、實時PCR、Western blotting等數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀況及體質(zhì)量變化

在腹腔注射前，Nab-PTX給藥組與對照組體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異。于第1、8、15天腹腔注射Nab-PTX后，與對照組相比，Nab-PTX 6 mg/kg組、4 mg/kg組體質(zhì)量下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異。給予Nab-PTX后，大鼠出現(xiàn)輕中度不良反應(yīng)，如腹瀉、戧毛、乏力、攝食減少、運動遲緩，體質(zhì)量下降等，考慮為化療藥物引起的不良反應(yīng)。見圖1。

圖1 Nab-PTX對大鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of Nab-PTX on the body mass of rats

2.2 行為學(xué)變化測定結(jié)果

2.2.1 PWMT的測定結(jié)果：在腹腔注射前，Nab-PTX給藥組與對照組PWMT無統(tǒng)計學(xué)差異。于第1、8、15天腹腔注射Nab-PT X，與對照組相比，Nab-PTX給藥組左后足PWMT均呈逐漸下降趨勢，于給藥后第21天，Nab-PTX給藥組大鼠PWMT降至最低點（P＜ 0.05）。隨著停藥時間的延長，Nab-PTX給藥組PWMT逐漸回升，至第35天PWMT逐漸恢復(fù)。Nab-PTX給藥組PWMT之間無統(tǒng)計學(xué)差異，表明Nab-PTX可誘發(fā)大鼠機械刺激痛覺超敏。見圖2。

圖2 Nab-PTX給藥組和對照組PWMT變化Fig.2 Change in PWMT in the Nab-PTX and control groups

2.2.2 PWTL的測定結(jié)果：給藥組于第1、8、15天腹腔注射Nab-PTX，與對照組相比，給藥組左后足PWTL均呈逐漸下降趨勢；給藥后第18天，Nab-PTX給藥組大鼠PWTL值呈最低值（P＜ 0.05）；隨著停藥時間的延長，Nab-PTX給藥組PWTL逐漸恢復(fù)，至給藥后第35天PWTL基本恢復(fù)正常。Nab-PTX給藥組PWTL之間無統(tǒng)計學(xué)差異，表明Nab-PTX可誘發(fā)大鼠熱輻射痛覺過敏反應(yīng)。見圖3。

圖3 Nab-PTX給藥組和對照組大鼠PWTL變化Fig.3 Change in PWTL in the Nab-PTX and control groups

2.3 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表達(dá)

ELISA法檢測結(jié)果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg組和4 mg/kg組TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)水平與對照組相比顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），然而IL-10表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異；Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異。證實了炎性細(xì)胞因子參與Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的脊髓炎癥反應(yīng)。見表2。

表2 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10蛋白水平（±s，pg/mL，n=10）Tab.2 Protein levels of TNF-α，IL-6，IL-1β，and IL-10 in the spinal cord of rats with neuropathic pain induced by Nab-PTX（±s，pg/mL，n=10）

表2 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10蛋白水平（±s，pg/mL，n=10）Tab.2 Protein levels of TNF-α，IL-6，IL-1β，and IL-10 in the spinal cord of rats with neuropathic pain induced by Nab-PTX（±s，pg/mL，n=10）

2.4 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中GFAP和Iba-1的激活情況

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組GFAP和Iba-1表達(dá)均升高；與對照組GFAP和Iba-1表達(dá)（分別為0.01±0.01和0.03±0.04）相比，Nab-PTX 6 mg/kg組GFAP和Iba-1表達(dá)（0.30±0.39和0.19±0.14）有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而Nab-PTX 4 mg/kg組GFAP和Iba-1表達(dá)（0.21±0.12和0.05±0.07）無統(tǒng)計學(xué)差異；Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間GFAP表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異；而Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間Iba-1表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.005）。證實了Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均被激活。見圖4、5。

2.5 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65的mRNA水平的表達(dá)

圖5 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中GFAP和Iba-1的表達(dá)Fig.5 GFAP and Iba-1 expression in the spinal cord of rats with Nab-PTX-induced neuropathic pain

實時PCR檢測結(jié)果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg和4 mg/kg大鼠脊髓中TLR4和NF-κBp65的mRNA水平均上調(diào)。Nab-PTX 6 mg/kg組TLR4和NF-κB p65的mRNA水平（分別為2.5±0.13和2.22±0.20）與對照組（均為1.00±0.00）及Nab-PTX 4 mg/kg組（1.47±0.30和1.46±0.30）相比均顯著上調(diào)（P＜ 0.01），然而Nab-PTX 4 mg/kg組與對照組TLR4和NF-κB p65的mRNA水平相比無統(tǒng)計學(xué)差異。證明腹腔注射Nab-PTX后，增加了大鼠脊髓組織中TLR4和NF-κB p65mRNA水平的表達(dá)。見圖6。

圖6 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中大鼠脊髓TLR4和NF-κB p65的mRNA的相對表達(dá)水平Fig.6 Relative expression of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in the spinal cord of rats with Nab-PTX-induced neuropathic pain

2.6 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65蛋白水平的表達(dá)

Western blotting檢測結(jié)果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg組和4 mg/kg組大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均增加。與對照組TLR4和NF-κB p65蛋白表 達(dá)（分別為0.09±0.03和0.28±0.04）相 比，Nab-PTX 6 mg/kg組TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)（0.26±0.05和0.66±0.05）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），而Nab-PTX 4 mg/kg組TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)（0.20±0.06和0.31±0.05）無統(tǒng)計學(xué)差異；Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間TLR4蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，而NF-κB p65蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.05）。證明腹腔注射Nab-PTX后，增加了大鼠脊髓組織中TLR4和NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平。見圖7。

圖7 Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平Fig.7 Protein expression of TLR4 and NF-κB p65 in the spinal cord of rats with Nab-PTX-induced neuropathic pain

3 討論

本研究結(jié)果顯示，藥物模型組PWMT和PWTL顯著降低，表明Nab-PTX可誘導(dǎo)大鼠機械刺激痛覺超敏和熱輻射痛覺過敏。同時發(fā)現(xiàn)Nab-PTX引起的神經(jīng)病理性疼痛，隨藥物的停用逐漸消失。其次，在Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中，大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、TLR4/NF-κB p65信號通路上調(diào)以及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌增加。這些結(jié)果表明Nab-PTX在脊髓中引起明顯的病理變化，這些可能是導(dǎo)致該藥物引起神經(jīng)病理性疼痛的原因之一。

目前研究［9］均在探索CIPN的確切機制及其最佳治療方法，在疼痛的背景下，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化之間存在重要差異。然而，在Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛動物模型中，GFAP、Iba-1均明顯的激活，提示星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均參與了Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，并且與藥物濃度相關(guān)。研究［10］表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞因子失調(diào)與多種神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。本研究中證實了炎性細(xì)胞因子參與Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的脊髓炎癥反應(yīng)，這與研究中［11］報道的CIPN產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子作用相同。因此，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能成為減輕Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛的潛在靶點。

近年來，關(guān)于TLR4在神經(jīng)病理性疼痛等免疫炎癥性疾病中的作用引起了廣泛關(guān)注，在免疫炎癥應(yīng)答和神經(jīng)病理性疼痛之間起重要連接作用［12］。TLR4 的活化最終表現(xiàn)在激活NF-κB，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的合成與分泌和啟動獲得性免疫應(yīng)答［13-14］。本研究結(jié)果顯示，TLR4/NF-κB參與了Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，從而釋放促進(jìn)疼痛行為的促炎細(xì)胞因子合成與分泌。

本研究成功構(gòu)建Nab-PTX誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，觀察了大鼠疼痛行為學(xué)變化及脊髓GFAP、Iba-1、TLR4、NF-κB p65及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的變化。本研究結(jié)果顯示，Nab-PTX引起神經(jīng)病理性疼痛的同時，可誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活、TLR4、NF-κB p65信號通路上調(diào)及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌增加，并且與藥物劑量相關(guān)。對上述通路及靶點進(jìn)行調(diào)節(jié)，有望找到一種新的神經(jīng)病理性疼痛治療手段，改善Nab-PTX化療引起的神經(jīng)病理性疼痛患者的臨床預(yù)后，為其治療以及藥物篩選提供新的研究方向。