呂雪梅，張洋洋，宋曉雯，劉明妍，杜可，王玉寶，魏敏杰，

（1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 110122；2.遼寧醫(yī)學(xué)診療科技研發(fā)中心有限公司研發(fā)部，沈陽 110002）

育齡女性肥胖發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，且與女性生殖功能障礙密切相關(guān)，研究［1-2］表明肥胖可以增加不孕風(fēng)險。肥胖會誘發(fā)激素綜合環(huán)境改變，導(dǎo)致下丘腦功能障礙、促性腺激素分泌異常、卵泡發(fā)育受損和排卵功能障礙等［3］。醫(yī)學(xué)上治療生殖障礙疾病往往采用輔助生殖技術(shù)或激素替代療法等方法，但效果并不理想，不良反應(yīng)明顯。

中醫(yī)認為不孕的病因繁多，腎虛、痰濕、肝郁、血淤均可造成不孕［4］。腎虛為其本，肝脾失調(diào)所致氣滯、痰濕、血淤為其標(biāo)，應(yīng)標(biāo)本兼治，肝腎脾同調(diào)［5］。因此，在中醫(yī)治療過程中以整體理論和辨證施治為基礎(chǔ)，調(diào)節(jié)機體氣血陰陽，從而提高卵巢功能的效果，具有相對西醫(yī)診療依從性高，不良反應(yīng)少，無創(chuàng)等優(yōu)點。本研究旨在探討補腎健脾方對肥胖大鼠生殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：5～6周齡SD雌性大鼠40只，雄性大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，飼養(yǎng)環(huán)境為（23±2）℃，相對濕度50%～70%，給予12 h光照，自由攝食飲水，常規(guī)適應(yīng)喂養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物與試劑：沙棘6 g，枸杞18 g，黑芝麻10 g，黃精12 g，烏梅12 g，大棗18 g，山藥23 g，葛根23 g，茯苓18 g，酸棗仁10 g，購自沈陽市大東區(qū)長生堂藥房。藥材制成濃度為1.20 g/mL的提取液。普通飼料（27%粗蛋白、13%粗脂肪、60%碳水化合物）；高脂飼料（20%粗蛋白，45%粗脂肪，35%碳水化合物）購自南京盛民科研動物養(yǎng)殖場；大鼠促卵泡激素（follice-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體激素（luteinizing，LH）、雌二醇（estradiol，E2）激素、抗繆勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）ELISA檢測試劑盒（北京誠林生物科技有限公司）；吉姆薩染色液R20649（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器：多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；分析天平（北京賽多科斯科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；石蠟切片機（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡成像顯微鏡（日本尼康公司）；切片掃描儀（日本濱松公司）；4 ℃高速離心機（上海Heal Force公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組：將雌性大鼠按隨機分組方法分為正常飲食組，高脂飲食組，補腎健脾方低、中、高劑量組（分別表示為ND組、HFD組、BSJP-L組、BSJP-M組和BSJP-H組），每組8只。各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ND組和HFD組給予生理鹽水灌胃，BSJP-L組，BSJP-M組和BSJP-H組分別按照150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg，1次/d灌胃給藥。飼養(yǎng)期間各組均自由飲食并飲清潔水，每周測量體質(zhì)量。喂養(yǎng)9周后按照高脂喂養(yǎng)大鼠體質(zhì)量均值高于ND組均值10%的標(biāo)準(zhǔn)［6］確認肥胖模型構(gòu)建成功。

1.2.2 顯微鏡下觀察肥胖鼠動情周期變化：大鼠動情周期包括動情前期（proestrus，P）、動情期（estrus，E）、動情后期（metestrus，M）、動情間期（diestrus，D）。飲食干預(yù)第8周開始每日對大鼠發(fā)情周期記錄12 d，按照參考文獻［7］描述的方法操作。4 d為1個周期，統(tǒng)計每個周期大鼠發(fā)情周期的比率。

1.2.3 大鼠受孕及產(chǎn)仔情況觀察：飲食干預(yù)第10周，按照雌雄2∶1進行合籠。記錄大鼠受孕率。孕鼠生產(chǎn)當(dāng)日記錄每只孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量。

1.2.4 脂肪指數(shù)測定：2%戊巴比妥40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)無菌方法取卵巢并剝離卵巢周圍脂肪，稱重后記錄，記錄卵巢周圍脂肪指數(shù)，脂肪指數(shù)=100×脂肪質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.5 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察：將各組大鼠的左側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)變化，并記錄卵泡數(shù)目。

1.2.6 大鼠血清FSH、LH、E2、AMH激素水平檢測：大鼠麻醉后，腹主動脈取血室溫靜置1 h后3 000 r/min離心，立即吸取上清分裝于-80 ℃保存。ELISA檢測各組大鼠血清中FSH、LH、E2、AMH激素水平，具體操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Graphpad Prism8作圖，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，多組間差異分析采用單因素方差分析（One-way-ANOVA），均數(shù)間兩兩比較采用Tukey’s multiple comparisons test 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方對大鼠體質(zhì)量的影響

高脂飲食喂養(yǎng)9周后，HFD組（313.7 g±15.6 g）相比于ND組（280.4 g±10.9 g）體質(zhì)量顯著增高（P＜0.01），BSJP-L組（286.8 g±5.3 g）、BSJP-M組（289.5 g±12.9 g）、BSJP-H組（286.6 g±20.4 g）相比于HFD組體質(zhì)量顯著降低（P＜ 0.05或＜ 0.01）。卵巢周圍脂肪指數(shù)HFD組（58.7±4.2）相比于ND 組（37.4±7.0）顯著增高（P＜ 0.001），而BSJP-M組和BSJP-H組（43.1±5.8和43.6±6.0）相比于HFD組脂肪指數(shù)均顯著下降（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 中藥復(fù)方對大鼠體質(zhì)量及脂肪指數(shù)的影響（±s，n=8）Fig.1 The effect of the prescription on rat body mass and fat index（±s，n=8）

2.2 陰道涂片觀察中藥復(fù)方對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠動情周期的影響

通過為期12 d的觀察，發(fā)現(xiàn)與ND組相比，HFD組E期所占比例明顯降低，M/D期所占比例明顯升高（P＜ 0.01）。BSJP-M組和BSJP-H組相比于HFD組E期比例明顯升高，M/D期所占比例顯著降低（P＜0.001或0.05），見表1。P期所占比例各組無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞ 0.05）。

表1 各組大鼠動情周期所占比例（±s，%，n=6）Tab.1 The percentage of rats in a particular phase of the estrous cycle in each group（±s，%，n=6）

表1 各組大鼠動情周期所占比例（±s，%，n=6）Tab.1 The percentage of rats in a particular phase of the estrous cycle in each group（±s，%，n=6）

1）P ＜ 0.000 1，2）P ＜ 0.001 vs ND group；3）P ＜ 0.001，4）P ＜ 0.05 vs HFD group.

2.3 中藥復(fù)方對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠受孕率及產(chǎn)仔數(shù)量的影響

HFD組（5/8，63%）與ND組（8/8，100%）相比受孕率下降，與HFD組相比各中藥復(fù)方組（均為8/8，100%）受孕率均有所提升。HFD組（5±3.4）相比于ND組（13±1.6）孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量顯著下降（P＜ 0.01），而與HFD組相比，BSJP-L組（14±2.3），BSJP-M組（13±0.7），BSJP-H組（11±1.3）產(chǎn)仔數(shù)量均顯著提升（P＜0.05）。

2.4 中藥復(fù)方對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠血清性激素的影響

與ND組比較，HFD組大鼠血清FSH、LH水平明顯升高（P＜ 0.01），E2、AMH水平明顯降低（P＜0.01）；與HFD組比較，不同劑量的中藥復(fù)方組大鼠血清FSH、LH水平均明顯降低（P＜ 0.05或＜ 0.01），BSJP-M組、BSJP-H組的E2、AMH水平均明顯升高（P＜0.05或＜ 0.001）。見表2。

表2 中藥復(fù)方對肥胖大鼠血清性激素的影響（±s，n=8）Tab.2 The effect of the prescription on serum sex hormones in obese rats（±s，n=8）

表2 中藥復(fù)方對肥胖大鼠血清性激素的影響（±s，n=8）Tab.2 The effect of the prescription on serum sex hormones in obese rats（±s，n=8）

1）P ＜ 0.001，2）P ＜ 0.01 vs ND group；3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01，5）P ＜ 0.001 vs HFD group.

2.5 中藥復(fù)方對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠卵巢組織病理學(xué)的影響

ND組大鼠卵巢組織可見各級卵泡，輪廓清晰；HFD組大鼠卵巢組織未見優(yōu)勢卵泡，生長卵泡少見，可見大的閉鎖卵泡，中藥復(fù)方組卵泡發(fā)育情況有所恢復(fù)，見圖2。與ND組（15±1.92）相比，HFD組（6.5±1.73）卵泡總數(shù)顯著下降（P＜ 0.001），而BSJP-L組（10±2.18）、BSJP-M組（13±1.85）、BSJP-H組（12±1.65）卵泡總數(shù)相比于HFD組均顯著提升（P＜0.05）。

圖2 中藥復(fù)方對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠卵巢組織病理學(xué)影響 HE×100Fig.2 The effect of the prescription on the ovarian histopathology of HFD-induced obese rats HE×100

3 討論

肥胖導(dǎo)致不孕的機制包括激素變化、月經(jīng)紊亂和排卵障礙［8-10］。有研究［11］表明，高脂飲食會損害女性下丘腦-垂體-卵巢軸的功能從而影響生育能力。中醫(yī)認為女性生殖障礙屬于“月經(jīng)過少，不孕，閉經(jīng)”等范疇。此類疾病與腎精不足、脾胃虛弱有關(guān)。肥胖的原因為水濕積聚，其病因也與腎虛脾虛相關(guān)。腎為先天之本，藏精，主生殖；脾為后天之本，生血，主運化。腎氣不足，胎元不固，脾氣不足，胎失滋養(yǎng)。補腎健脾方除了具有滋陰養(yǎng)血，健脾益氣的療效外，還具有減肥功效。史志萍等［12］研究納入120例圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)期婦女作為研究對象，發(fā)現(xiàn)補腎健脾中藥可降低圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)期婦女的體質(zhì)量指數(shù)，提高生殖激素E2水平，降低FSH及LH水平。沈明潔等［13］研究表明補腎健脾方有助于改善自然衰老小鼠的卵子質(zhì)量，在一定程度上改善自然衰老小鼠的生殖能力。金志春等［14］研究納入505例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者作為研究對象，觀察到補腎健脾調(diào)和氣血中藥治療2個療程后可以顯著提高復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠率以妊娠成功率。因此，探究補腎健脾方對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的生殖功能改善作用具有重要意義。

本研究成功建立肥胖模型，HFD組大鼠E期所占比例顯著下降，M/D期比例顯著延長，受孕率下降，產(chǎn)仔數(shù)量顯著下降，生殖激素 FSH和LH顯著增高，E2和AMH顯著下降，閉鎖卵泡增多，卵泡總數(shù)顯著減少。表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，可導(dǎo)致生殖激素水平紊亂，生殖能力下降。經(jīng)過補腎健脾方治療后，各劑量組的體質(zhì)量相比于HFD組均顯著下降，表明本組方可改善肥胖大鼠體質(zhì)量。BSJP-M組和BSJP-H組相比于HFD組E期所占比例延長，M/D期比例顯著縮短，生殖激素FSH和LH水平顯著下降，E2、AMH水平顯著增高，受孕率提升，產(chǎn)仔數(shù)量增多，卵巢形態(tài)改善，卵泡總數(shù)提升。表明本補腎健脾方可以改善肥胖大鼠動情周期紊亂，改善激素水平紊亂，提高生殖能力。

綜上所述，本中藥復(fù)方通過下調(diào)性激素FSH及LH水平，上調(diào)E2及AMH水平，從而改善肥胖大鼠的生殖能力。