黃鑫，朱璐，林梅青，王繼蕊，商秀麗

（中國醫(yī)科大學 1.附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽 110001；2.附屬盛京醫(yī)院康復中心，沈陽 110136；3.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是慢性進展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理學標志包括β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）積聚、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元變性等［1］。神經(jīng)血管功能障礙促進AD的發(fā)生發(fā)展。血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分［2］。生理條件下，BBB能選擇性地限制毒素從外周血液進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)新陳代謝，維持大腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［3-4］。內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白是維持BBB生理功能的重要結(jié)構(gòu)基礎。研究［5］顯示，AD發(fā)病早期就出現(xiàn)了BBB通透性增加和血管損傷等功能障礙。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt的非編碼轉(zhuǎn)錄本，在多種生物學過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。越來越多的研究［7］表明，lncRNA可對下游靶基因的染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控產(chǎn)生影響。研究［8］發(fā)現(xiàn)，lncRNA在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾?。òd癇、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和遺傳性疾病等）中表達失調(diào)。MEG8是小核仁宿主基因，定位于染色體14q32.3的基因簇中。MEG8通過吸附miR-181a-5p抑制氧化低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移，并誘導細胞凋亡，參與對動脈粥樣硬化進程的調(diào)控［9］。MEG8可通過與多梳抑制復合物2（EZH2）蛋白的增強子結(jié)合，誘導組蛋白H3甲基化并調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的細胞形態(tài)學變化［10］。目前，關(guān)于MEG8在AD微環(huán)境下BBB中調(diào)節(jié)作用的研究尚未見報道。

在體外AD微環(huán)境BBB的研究中，目前是以Aβ處理的人腦微血管內(nèi)皮細胞模擬AD微環(huán)境下BBB來進行。本研究探討MEG8對AD微環(huán)境下BBB通透性的作用，旨在為AD早期BBB的功能改變提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人腦微血管內(nèi)皮細胞hCMEC/D3由法國巴黎第五大學COURAUD教授惠贈，EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。人腦正常星形膠質(zhì)細胞（normal human astrocyte，NHA）購自上海中科院細胞庫，DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。所有細胞均于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d細胞換液或者傳代。Aβ（美國Sigma公司）溶解后加入細胞中共同孵育。

1.2 構(gòu)建體外BBB模型并進行Aβ處理

NHA細胞接種于6孔Transwell小室（0.4微孔膜）的下室，加入3 mL的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞長至約80%后，將2×105個Aβ處理的人腦微血管內(nèi)皮細胞（Aβ-incubated human brain microvascular endothelial cells，AD-ECs）接種于鼠尾膠原預處理的Transwell小室的上室。上下室內(nèi)均加入適量的EBM-2完全培養(yǎng)液。48 h后換液，培養(yǎng)4 d后體外BBB模型建立。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默MEG8質(zhì)粒及分組

待細胞長至接近80%融合時，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX說明書，應用Lipofectamine LTX試劑將MEG8沉默質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中，48 h后顯微鏡下觀察細胞帶光情況。隨后，應用G418篩選細胞，每隔24 h梯度（0.2 mg/mL）加藥1次，最高至2 mg/mL篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的AD-ECs。按照細胞處理方法分為：對照組、轉(zhuǎn)染MEG8陰性對照組（sh-NC組）、轉(zhuǎn)染MEG8沉默質(zhì)粒組（sh-MEG8組）。

1.4 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測

使用TRIzol提取細胞中的總RNA，測定RNA濃度。獲取的RNA應用染料法一步法試劑盒來檢測MEG8的表達情況。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.5 跨內(nèi)皮阻抗（transendothelial electric resistance，TEER）值測定

應用微孔電阻系統(tǒng)檢測TEER值，在37 ℃恒溫下檢測各組TEER值的變化，每組樣品讀數(shù)減去空白Transwell小室的微孔膜背景電阻值，之后與Transwel小室表面積的乘積為最終TEER值（Ω·cm2）。

1.6 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）含量測定

應用轉(zhuǎn)染細胞建立體外BBB模型后，將含有0.5 μmol/L HRP的無血清EBM-2培養(yǎng)基加入Transwell小室的上室中，收集下室的培養(yǎng)基并通過TMB顯色法測量HRP含量（pmol/cm2）。

1.7 免疫熒光觀察

選取生長狀態(tài)良好的細胞培養(yǎng)在含1%明膠包被的蓋玻片上，待細胞生長融合至95%～100%時，PBS清洗3次。4%多聚甲醛（ZO-1）室溫固定30 min后0.3% Trixton-100室溫通透10 min，或甲醇（occludin無需通透）-20℃ 固定10 min，PBS清洗3次。5%BSA室溫封閉2 h，PBS清洗3次。加入1%BSA稀釋的一抗（ZO-1和 occludin均1∶50稀釋），4 ℃ 濕盒孵育過夜。復溫45 min，PBST清洗3次，每次5 min。加入1%BSA稀釋的 Cy3標記熒光二抗山羊抗兔（1∶500）避光于抗體孵育盒中室溫孵育1.5 h。PBST避光清洗3次，每次5 min。DAPI避光染核5～8 min，PBS避光清洗3次，每次5 min?？篃晒獯銣绶馄悍馄?，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.8 Western blotting檢測

搜集細胞樣品，加入適量裂解液震蕩混勻，置于冰上裂解45 min，超聲粉碎，4 ℃ 17 000 r/min離心40 min，收集上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，并計算上樣量。等量的蛋白樣品液（40～50 μg）經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后，按一定比例稀釋一抗（ZO-1 1∶600；occludin 1∶600）4 ℃孵育過夜。HRP標記的二抗室溫孵育1.5 h。GAPDH作為內(nèi)參。ECL發(fā)光、拍照，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的相對整合密度值比值表示。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MEG8在AD-ECs中的表達

結(jié)果顯示，人腦微血管內(nèi)皮細胞和AD-ECs中MEG8的表達分別為1.00±0.00和2.05±0.29。與人腦微血管內(nèi)皮細胞比較，MEG8在AD-ECs中表達顯著升高（P＜ 0.01）。

2.2 沉默MEG8的轉(zhuǎn)染效率

應用qRT-PCR檢測沉默MEG8的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，在質(zhì)粒1和質(zhì)粒2中，與shNC組比較，sh-MEG8表達均顯著降低（P＜ 0.01），質(zhì)粒1中的轉(zhuǎn)染效率更高（P＜ 0.05）。因此選擇質(zhì)粒1篩選的細胞進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 AD-ECs中沉默MEG8的轉(zhuǎn)染效率比較Fig.1 Comparison of transfection efficiency of deletion of MEG8 in AD-ECs

2.3 沉默MEG8表達對AD微環(huán)境下BBB通透性的影響

結(jié)果顯示，與對照組比較，sh-NC組TEER值和HRP滲出量無顯著變化（均P＞ 0.05）；與sh-NC組比較，sh-MEG8組TEER值顯著增加（P＜ 0.01），HRP滲出量顯著降低（P＜ 0.01），提示沉默MEG8表達能夠降低AD微環(huán)境下BBB的通透性。見圖2。

圖2 沉默MEG8表達對AD微環(huán)境BBB通透性的影響Fig.2 Effects of deletion of MEG8 on the BBB permeability of AD microenvironment

2.4 沉默MEG8對AD微環(huán)境下血管內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin分布的影響

結(jié)果顯示，與sh-NC組比較，sh-MEG8組緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin呈現(xiàn)相對連續(xù)分布。見圖3。

圖3 沉默MEG8對AD微環(huán)境中緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin分布的影響Fig.3 Effects of deletion of MEG8 on the distribution of ZO-1 and occludin in AD microenvironment

2.5 沉默MEG8表達對AD微環(huán)境下血管內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin表達的影響

結(jié)果顯示，與對照組比較，sh-NC組ZO-1和occludin的表達無統(tǒng)計學差異（均P＞ 0.05）。與sh-NC組比較，sh-MEG8組ZO-1和occludin表達顯著升高（均P＜0.01），提示沉默MEG8表達能上調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin表達水平。見圖4。

圖4 沉默MEG8表達對AD微環(huán)境下中ZO-1和occludin蛋白表達的影響Fig.4 Effects of deletion of MEG8 on the expression of ZO-1 and occludin in AD microenvironment

3 討論

本研究首次證明了lncRNA MEG8在AD-ECs中高表達，沉默MEG8表達顯著增加AD微環(huán)境下BBB的TEER值，降低HRP滲出量。此外，沉默MEG8表達使緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin在AD-ECs中表達顯著增加，同時在AD-ECs的邊界上呈現(xiàn)相對連續(xù)的分布，提示MEG8可能通過影響緊密連接相關(guān)蛋白的表達和分布進而調(diào)控AD微環(huán)境下BBB的通透性。

BBB是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的動態(tài)和復雜的界面，血管內(nèi)皮細胞的緊密連接相關(guān)蛋白是BBB的主要物理屏障組分，通過細胞旁途徑調(diào)節(jié)通透性。TEER值是檢測BBB完整性的指標，HRP滲出量是檢測BBB滲透性的指標，同時檢測TEER值和HRP滲出量是目前公認的研究BBB通透性的指標。既往研究［11］表明，AD微環(huán)境下BBB的通透性增加，與本研究結(jié)果一致。MEG8在AD-ECs中高表達，沉默MEG8表達顯著增加了AD微環(huán)境下BBB的TEER值，降低HRP滲出量，提示沉默MEG8表達可顯著降低AD微環(huán)境下BBB的通透性。

在調(diào)節(jié)BBB通透性的細胞旁途徑中，血管內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin的分布與表達水平的變化直接影響B(tài)BB通透性［12-13］。在AD的發(fā)生發(fā)展進程中，特別是AD發(fā)病的早期，BBB通透性的改變發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默MEG8表達使AD-ECs邊界的緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin呈現(xiàn)相對連續(xù)的分布，顯著增加了ZO-1和occludin的蛋白表達水平。有研究［15］報道，Aβ處理顯著降低了血管內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白occludin和ZO-1的表達水平，損害了小鼠腦中BBB的完整性。上述研究結(jié)果均提示細胞旁途徑的改變是AD早期BBB通透性變化的重要途徑，而沉默MEG8表達可通過降低BBB的通透性發(fā)揮一定程度的保護作用。

近來研究［16］表明，lncRNA與PI3K-Akt、MTOR、AMPK等信號通路相互調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)AD的發(fā)生發(fā)展。lncRNA 17A在Aβ孵育的SH-SY5Y細胞中表達失調(diào)，過表達lncRNA 17A促進細胞自噬，誘導神經(jīng)變性［17］。β-分泌酶1（beta-secretase 1，BACE1）與淀粉樣蛋白沉積相關(guān)，研究［18］發(fā)現(xiàn)BEACE1反義鏈可通過調(diào)節(jié)BACE1的表達在AD的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)MEG8在AD-ECs中高表達。沉默MEG8表達使AD-ECs緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和occludin呈現(xiàn)相對連續(xù)的分布，ZO-1和occludin表達水平顯著增加。提示沉默MEG8的表達可通過改變ZO-1和occludin的細胞分布，增加ZO-1和occludin的蛋白表達水平來降低AD微環(huán)境下BBB的通透性，從而發(fā)揮一定的保護作用。LINC00662在Aβ處理的人腦ECs中高表達，沉默LINC00662表達可通過改變ZO-1、occludin和Claudin-5的細胞分布，增加Z O-1、occludin和Claudin-5的蛋白表達水平來降低AD微環(huán)境下BBB通透性［12］，與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，MEG8在AD-ECs中表達上調(diào)，沉默MEG8表達顯著降低AD微環(huán)境下BBB的通透性，其作用機制可能是通過改變ZO-1和occludin的細胞分布，增加ZO-1和occludin蛋白表達實現(xiàn)的。MEG8在AD微環(huán)境下BBB的功能調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用，但是，AD微環(huán)境下BBB的功能調(diào)節(jié)是多維度、多層次、多細胞、多分子共同參與的，因此，從不同層次的調(diào)控網(wǎng)絡來探討AD微環(huán)境下BBB通透性的變化，有望為AD的早期防治提供新策略。