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        不同預(yù)處理方法消除流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子分析干擾的效果

        2022-02-04 01:48:42唐甜王盼劉宇思姜擁軍趙敏張子寧
        關(guān)鍵詞:沉淀法倍數(shù)電化學(xué)

        唐甜,王盼,劉宇思,姜擁軍,趙敏,張子寧

        (中國醫(yī)科大學(xué) 1.國家衛(wèi)生健康委員會艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.國家醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心;3.遼寧省艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4.附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,沈陽 110001)

        細(xì)胞因子作為一種小分子蛋白,在炎癥、感染、腫瘤、自身免疫病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義,可為免疫相關(guān)疾病的診斷、預(yù)后評估、療效監(jiān)測等提供輔助診斷依據(jù)[1]。目前,隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展,利用流式細(xì)胞儀檢測患者血清或血漿中的細(xì)胞因子水平被越來越廣泛地用于臨床[2]。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子基于流式微球陣列技術(shù),可同時檢測一份血清或血漿樣本中的多種細(xì)胞因子,且具有需要樣本量少、省時、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。然而,嗜異性抗體(heterophil antibody,HA)的存在會對基于抗原和抗體的免疫測定法產(chǎn)生干擾,影響流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子的特異度和準(zhǔn)確性[3-4]。因此,本研究采用稀釋法、20%聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000,PEG-6000)沉淀法和嗜異性抗體阻斷管(heterophilic blocking tube,HBT)預(yù)處理流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測結(jié)果異常升高的血漿樣本,并將預(yù)處理后血漿樣本的白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果進(jìn)行比較,以探索有效解決流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞因子檢測結(jié)果異常升高的血漿樣本干擾的方法,為臨床診治提供準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

        1 材料與方法

        1.1 研究對象

        收集2021年6月至9月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科采用流式細(xì)胞術(shù)檢測的血漿樣本2 100例,本研究納入細(xì)胞因子異常升高的血漿樣本,共32例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)7種細(xì)胞因子均異常升高;(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形異常;(3)部分細(xì)胞因子檢測結(jié)果與患者臨床表現(xiàn)以及C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞沉降率檢測結(jié)果不符。

        同期隨機(jī)收集正常對照血漿樣本14例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)細(xì)胞因子檢測圖形正常,且細(xì)胞因子檢測結(jié)果與患者臨床表現(xiàn)以及C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞沉降率檢測結(jié)果相符;(2)性別、年齡等因素與異常樣本相匹配。本研究通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核和批準(zhǔn)[科倫審2021(518)號]。

        1.2 儀器和試劑

        BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司),細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF)聯(lián)合檢測試劑盒(江西賽基生物科技有限公司),20% PEG-6000(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),HBT(美國CANTIBODIES公司),Cobas 8000A電化學(xué)發(fā)光儀(美國羅氏公司)。

        1.3 樣本采集、預(yù)處理和檢測

        1.3.1 樣本采集:將外周靜脈血置于乙二胺四乙酸真空采血管中,在室溫條件下2 000g離心10 min后,留取血漿進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。

        1.3.2 樣本預(yù)處理:對32例細(xì)胞因子異常升高的血漿樣本分別進(jìn)行不同預(yù)處理后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿細(xì)胞因子水平。

        1.3.2.1 稀釋法預(yù)處理 使用細(xì)胞因子檢測試劑的配套樣本稀釋液,對血漿樣本進(jìn)行2倍、4倍和8倍稀釋。

        1.3.2.2 PEG-6000預(yù)處理 將20% PEG-6000與等體積的血漿充分混勻,于室溫條件下振蕩1 h后,350g離心10 min,吸取上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。

        1.3.2.3 HBT預(yù)處理 取500 μL血漿,加入阻斷管中靜置1 h,吸取上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。

        1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿細(xì)胞因子水平:將孵育好、包被7種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF)特異性抗體的捕獲微球振蕩混勻后,向每個樣品管中加入25 μL。再向所有管中分別加入25 μL 藻紅蛋白熒光檢測試劑和25 μL待測血漿,振蕩混勻,室溫避光孵育3 h。待孵育完成后,每管加入1 mL PBS洗滌,350g離心5 min,棄上清后向每管加入100 μL PBS,振蕩重懸后,上BD FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,采用FCAP Array軟件分析、計(jì)算結(jié)果。

        1.3.4 電化學(xué)發(fā)光法檢測IL-6水平:將未經(jīng)預(yù)處理的血漿2 000g離心10 min后,直接采用Cobas 8000A電化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        使用FacsDivaTM軟件處理流式細(xì)胞術(shù)獲得的數(shù)據(jù),應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用M(P25~P75)表示,2組間配對比較采用Wilcoxon檢驗(yàn),多組間配對比較采用Friedman檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析,一致性分析采用Bland-Altman法。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿細(xì)胞因子結(jié)果分布情況

        2 100例血漿樣本中,2 068例(98.5%)血漿樣本中7種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF)流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形正常(以下簡稱正常表現(xiàn)),包括所有細(xì)胞因子表達(dá)水平在參考區(qū)間內(nèi)(圖1A)或部分細(xì)胞因子表達(dá)水平高于參考區(qū)間上限(圖1B),32例(1.5%)血漿樣本多細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形異常(以下簡稱異常表現(xiàn)),表現(xiàn)為流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形拉長(圖1C),或所有細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果均異常升高(圖1D)。32例細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本中,24例(75.0%)來源于風(fēng)濕免疫科,4例(12.5%)來源于腫瘤內(nèi)科,3例(9.4%)來源于血液科,1例(3.1%)來源于器官移植科。

        圖1 血漿細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測圖Fig.1 Flow cytometry detection diagram of cytokines in plasma

        2.2 稀釋法預(yù)處理血漿樣本后細(xì)胞因子的檢測結(jié)果

        將血漿樣本2倍、4倍、8倍稀釋后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿中7種細(xì)胞因子的表達(dá)水平。在32例細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本中,7種細(xì)胞因子的檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系(P> 0.05,r<0.97)的比例均>60%(圖2A)。在14例細(xì)胞因子正常表現(xiàn)的血漿樣本中,7種細(xì)胞因子的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)均呈較好的線性關(guān)系,以IL-6為例(P< 0.05,r> 0.97),見圖2B;而在32例細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本中,血漿樣本稀釋后21例(65.6%)IL-6檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)的線性關(guān)系較差(P> 0.05,r< 0.97,圖2C),其余11例(34.4%)IL-6檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)呈較好的線性關(guān)系。

        圖2 血漿樣本經(jīng)倍比稀釋后細(xì)胞因子的表達(dá)情況Fig.2 Expression of cytokines in plasma pretreated by a multiple dilution method

        2.3 PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理血漿樣本后細(xì)胞因子的檢測結(jié)果

        細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本經(jīng)PEG-6000沉淀法或HBT預(yù)處理后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿中7種細(xì)胞因子的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子異常升高的現(xiàn)象均得到改善,見圖3。

        圖3 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同方法預(yù)處理細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本后7種細(xì)胞因子的檢測結(jié)果Fig.3 Seven cytokines in plasma samples detected by flow cytometry after different pretreatment methods

        細(xì)胞因子正常表現(xiàn)的血漿樣本經(jīng)PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理后,與未經(jīng)預(yù)處理的血漿樣本比較,7種細(xì)胞因子的檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,圖4A)。

        與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本,經(jīng)PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理后,7種細(xì)胞因子的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果均明顯低于未經(jīng)預(yù)處理的血漿樣本(PEG-6000:均P< 0.001;HBT:均P< 0.01),見圖4B~4H。與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本,經(jīng)PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理后,部分細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果明顯低于未經(jīng)預(yù)處理的血漿樣本(PEG-6000:IL-6,P< 0.01,IL-10,P< 0.01,IFN-γ,P< 0.01,TNF,P< 0.000 1;HBT:IL-10,P< 0.01,IFN-γ,P<0.01;TNF,P< 0.000 1),見圖4I~4O。

        圖4 PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理血漿樣本后細(xì)胞因子的檢測結(jié)果Fig.4 Expression levels of the cytokines in plasma samples pretreated by PEG-6000 precipitation and HBT

        2.4 不同方法預(yù)處理血漿樣本后流式細(xì)胞術(shù)與電化學(xué)發(fā)光法IL-6檢測結(jié)果的相關(guān)性和一致性

        對32例細(xì)胞因子異常表現(xiàn)的血漿樣本(包括11例與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的血漿樣本和21例與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的血漿樣本)進(jìn)行PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),未經(jīng)預(yù)處理血漿樣本的IL-6流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)低,經(jīng)PEG-6000沉淀法和HBT預(yù)處理后血漿樣本的IL-6流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)性增加,且PEG-6000沉淀法預(yù)處理的血漿樣本IL-6檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)高于HBT預(yù)處理的血漿樣本(與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的血漿樣本:PEG-6000,r=0.981 7,HBT,r=0.761 5,圖5A~5C;與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的血漿樣本:PEG-6000,r=0.854 4,HBT,r=0.830 9,圖5D~5F)。

        圖5 不同方法預(yù)處理血漿樣本后流式細(xì)胞術(shù)與電化學(xué)發(fā)光法IL-6檢測結(jié)果的相關(guān)性Fig.5 Correlation of IL-6 detected by flow cytometry after different pretreatment methods and electrochemiluminescence

        進(jìn)一步進(jìn)行Bland-Altman分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),未經(jīng)預(yù)處理、PEG-6000沉淀法預(yù)處理和HBT預(yù)處理后的血漿樣本中,流式細(xì)胞術(shù)與電化學(xué)發(fā)光法IL-6檢測結(jié)果具有較好的一致性,約90.5%(19/21,21例與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的血漿樣本)~90.9%(10/11,11例與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的血漿樣本)的點(diǎn)在95%一致性界限以內(nèi)。且PEG-6000沉淀法差值的絕對值以及差值的標(biāo)準(zhǔn)差最?。ㄅc稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的血漿樣本:-1.80±3.57;與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的血漿樣本:-2.17±5.15),表明PEG-6000沉淀法預(yù)處理血漿后,流式細(xì)胞術(shù)與電化學(xué)發(fā)光法IL-6檢測結(jié)果的一致性更好。見圖6。

        圖6 不同方法預(yù)處理血漿樣本后流式細(xì)胞術(shù)與電化學(xué)發(fā)光法IL-6檢測結(jié)果的一致性Fig.6 Consistency of IL-6 detected by flow cytometry after different pretreatment methods and electrochemiluminescence

        3 討論

        HA是人體內(nèi)源性抗體,在人類接種來源于動物的疫苗以及直接接觸已經(jīng)污染的食物、動物后會產(chǎn)生HA[5]。HA能與多個物種的免疫球蛋白非特異性結(jié)合,屬多重特異性免疫球蛋白。因此,體內(nèi)含HA的患者在做血清免疫檢測時,HA可與試劑抗體結(jié)合而產(chǎn)生干擾。HA的干擾通常會對一種或多種分析物造成錯誤的高值結(jié)果,假性高值結(jié)果較常見[6-7],與本研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子檢測假性升高情況符合。研究發(fā)現(xiàn),存在于人體中的HA包括天然抗體和自身免疫抗體,天然抗體分為天然多特異性抗體、獨(dú)特型抗體和類風(fēng)濕性因子,大多數(shù)的HA屬于天然抗體,是免疫檢測分析干擾的主要類型[8]。我院絕大部分患者7種細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF)的檢測結(jié)果均正常,32例細(xì)胞因子檢測結(jié)果出現(xiàn)異常升高的患者中,24例來自風(fēng)濕免疫科,其中23例類風(fēng)濕因子升高。提示類風(fēng)濕因子升高可能是干擾流式細(xì)胞術(shù)多細(xì)胞因子檢測結(jié)果的主要原因,臨床檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子圖形異?;蚺c臨床不符時,可關(guān)注類風(fēng)濕因子表達(dá)水平。

        鑒于HA的多重源性,目前尚無一種能夠完全消除HA干擾的手段。連續(xù)稀釋實(shí)驗(yàn)是發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)中內(nèi)源性抗體和測量不準(zhǔn)確性的有效方法,將血漿樣本稀釋后,能夠降低HA濃度,從而降低原有的干擾強(qiáng)度[9-10]。本研究中,21例患者(21/32)的待檢血漿樣本經(jīng)連續(xù)稀釋后,細(xì)胞因子的檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)仍未呈明顯線性關(guān)系,稀釋法有效降低干擾的效率僅為34.5%,效果不明顯。另外,在與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的樣本中,PEG-6000、HBT預(yù)處理后血漿樣本的細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果以及未經(jīng)預(yù)處理血漿樣本的細(xì)胞因子電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果大部分降低,部分細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-10等顯著下降,這種情況可能是由于這些患者體內(nèi)HA具有較強(qiáng)的抗體結(jié)合能力,不會隨著稀釋而下降[11]。因此,檢測結(jié)果與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的樣本也不能排除存在HA干擾。

        另外一種降低HA干擾的方法是使用HA阻斷劑,加入阻斷試劑或使用HBT,均是利用阻斷劑與HA結(jié)合從而達(dá)到減少干擾的目的。研究[12]報(bào)道,HBT能有效降低電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測游離前列腺特異性抗原等細(xì)胞因子的假陽性率。目前,細(xì)胞因子檢測尚無金標(biāo)準(zhǔn),本研究更換了檢測平臺,同時使用電化學(xué)發(fā)光法檢測IL-6的水平,HBT預(yù)處理后的血漿樣本流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果的相關(guān)性有所提高,與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的樣本差值的絕對值由原來的10.48 pg/mL降為6.07 pg/mL,與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的樣本差值的絕對值由原來的16.70 pg/mL降為4.97 pg/mL,且從流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形來看,HBT預(yù)處理也能較好地矯正檢測圖形(圖4C)。因此,HBT在一定程度上能夠有效降低干擾。但是,本研究結(jié)果中也出現(xiàn)HBT預(yù)處理未能有效降低細(xì)胞因子檢測結(jié)果異常升高的情況,檢測圖形也未得到明顯改善,這可能因?yàn)檫@些樣本中存在HBT預(yù)處理不能阻斷的大分子蛋白。

        PEG-6000是一種大分子聚合物,具有很強(qiáng)的親水性,可以破壞水化層使蛋白質(zhì)分子發(fā)生脫水,同時通過空間排斥作用擠壓以及依靠鏈長纏繞蛋白質(zhì)分子而使其發(fā)生沉淀,25% PEG-6000溶液可完全沉淀IgG和IgM以及高達(dá)80%的IgA[12]。PEG-6000能有效降低腎上腺激素、促甲狀腺素、腫瘤標(biāo)志物、心臟生物標(biāo)志物等檢測中HA干擾導(dǎo)致的非特異性反應(yīng)[13-15]。本研究使用PEG-6000降低HA的干擾,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入20% PEG-6000對流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子的正常表現(xiàn)結(jié)果不產(chǎn)生影響。對于流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形異常表現(xiàn)結(jié)果,與稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系的血漿樣本流式細(xì)胞術(shù)IL-6檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)性較好,配對數(shù)據(jù)差值的絕對值由原來的10.48 pg/mL降為1.80 pg/mL,與稀釋倍數(shù)未呈線性關(guān)系的血漿樣本流式細(xì)胞術(shù)IL-6檢測結(jié)果與電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)性增加,配對數(shù)據(jù)差值的絕對值由原來的16.70 pg/mL降為2.17 pg/mL,而且PEG-6000沉淀法能較好地矯正流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形。因此,PEG-6000沉淀法可以有效減弱分析干擾。

        綜上所述,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子時,如發(fā)現(xiàn)異常流式細(xì)胞術(shù)檢測圖形,應(yīng)考慮是否存在干擾,PEG-6000沉淀法和HBT均能在一定程度上降低HA的干擾,其中PEG-6000沉淀法的配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差最小,與電化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性也較好。同時,PEG-6000除了可沉淀HA,對大分子蛋白也有較好的沉淀效果,且其使用成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HBT[12]。因此,細(xì)胞因子的流式細(xì)胞術(shù)檢測中可以嘗試應(yīng)用PEG-6000沉淀法來減弱內(nèi)源性抗體的干擾,提高檢測的準(zhǔn)確性。

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