喻言，鐘紅珊

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院介入治療科，沈陽 110001）

鐵死亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，是一種受調節(jié)的細胞死亡形式，與其他已知的細胞死亡模式（如細胞凋亡、壞死和自噬）不同，具有獨特的形態(tài)、生化和遺傳特征，如線粒體萎縮、膜密度增加、鐵和活性氧（reactive oxygen species，ROS）超載［1-6］。鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis-suppressor-protein 1，F(xiàn)SP1）在包括肝癌在內的多種腫瘤細胞中高表達，發(fā)揮抑制腫瘤細胞鐵死亡的作用［7］。

musahi RNA結合蛋白2（musashi RNA binding protein 2，MSI2）是一種RNA結合蛋白，可通過高表達調控Wnt/β-catenin通路，促進肝癌細胞生長［8-10］。MSI2高表達還能增強人肺腺癌細胞的化療藥物耐藥性，發(fā)揮促癌作用［11］。RNA結合蛋白能與環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）兩端側翼序列的Alu元件結合，誘導其5’端和3’端的共價結合，促進circRNA的形成［12］。本研究組前期通過生物信息學研究發(fā)現(xiàn)，circFGGY的兩端也存在Alu元件，可能與MSI2結合。FGGY可在多種腫瘤中發(fā)揮作用［13］，但circFGGY在肝癌細胞中的表達和功能目前尚不明確。

m6A甲基化是指發(fā)生在腺嘌呤第6個氮原子上的甲基化修飾，廣泛存在于許多真核生物的RNA中［14］。circRNA也存在m6A修飾，由去甲基化酶FTO和甲基轉移酶METTL3等相關酶共同調控［15］。METTL3在肝癌細胞中高表達，并發(fā)揮促癌基因作用［16］。m6A甲基化修飾還可導致circRNA在細胞核和細胞質中的位置重分布。

本研究擬探討circFGGY、MSI2、METTL3、FSP1對肝癌細胞鐵死亡的調控，旨在明確肝癌細胞鐵死亡的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人正常肝細胞系WRL68及肝癌細胞系HepG2購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑及材料：Western blotting相關試劑（上海碧云天生物技術有限公司）；FSP1抗體和GAPDH抗體，Lipofectamine3000，Opti-MEM?Ⅰ（美國Life公司）；鼠、兔二抗（美國Santa Cruz公司）；TRIzol試劑（上海聯(lián)邁生物公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、RNase R、脂質過氧化物試劑盒（美國Sigma公司）；TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit，TaqMan?Universal Master MixⅡ（美國Ambion公司）；circFGGY引物設計及合成（中國上海閃晶公司）；MSI2、METTL3及circFGGY沉默質粒（蘇州吉瑪公司）；免疫熒光相關探針及試劑盒（中國邁新基因公司）；CCK-8試劑盒（日本東仁公司）；C11-BODIPY染色測定試劑盒（深圳子科生物科技有限公司）；鐵測定試劑盒，谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR：應用TRIzol試劑提取HepG2細胞總RNA，加入RNase R降解線狀RNA。應用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit反轉錄，應用TaqMan?Universal Master MixⅡ和TaqMan MicroRNA Assay（circFGGY）行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內參照。應用7500Fast Real-Time PCR System測定Ct值，以2-ΔΔCt表示circFGGY的相對表達量。

1.2.2 細胞轉染及分組：接種5×104個HepG2細胞至24孔板，待細胞生長至70% 融合時，按照Lipofectamine3000說明書，分別轉染MSI2、METTL3及circFGGY的沉默質粒，用0.4 mg/mL G418篩選細胞。4周后，篩選出穩(wěn)定轉染的細胞系。將細胞分為陰性對照（sh-NC）組和沉默組。

1.2.3 CCK-8實驗：96孔板中加入5×105/μL細 胞懸液100 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。加入CCK-8溶液10 μL/孔，培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標儀在450 nm處檢測各孔吸光度。

1.2.4 脂質過氧化物檢測：按照試劑盒說明書，取細胞懸液至1.5 mL離心管中，加入700 μL 檢測試劑，45 ℃孵育60 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL加入96孔板中，用酶標儀在586 nm波長下測定各孔吸光度。

1.2.5 C11-BODIPY染色：4%多聚甲醛固定細胞15 min后，0.5% Triton X-100 溶液處理20 min；普通山羊血清封閉30 min，4 ℃下與C11-BODIPY探針孵育1 h；與 FITC 標記的山羊抗兔 IgG在 37 ℃暗室中孵育1 h；DAPI染色5 min，拍照成像。

1.2.6 流式細胞儀檢測ROS：用無血清培養(yǎng)液稀釋活性氧熒光探針（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）（1∶1 000），使終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋DCFH-DA。37℃培養(yǎng)箱內孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。收集細胞并懸浮于DCFH-DA（1∶1 000稀釋）中，培養(yǎng)箱內孵育20 min。每3～5 min混勻1次。用流式細胞儀檢測。

1.2.7 細胞鐵離子測定：預冷PBS清洗細胞2次，加入裂解液（200 μL/孔），在搖床上裂解細胞2 h。加入鐵離子檢測試劑盒的檢測試劑，混勻，60 ℃ 孵育1 h，冷卻至室溫并離心。加入30 μL鐵離子檢測劑并混勻，室溫孵育30 min。取200 μL至96孔板，用酶標儀檢測550 nm處吸光度。

1.2.8 細胞GSH檢測：裂解細胞后，加入GSH檢測試劑，加至96孔板。用酶標儀檢測340 nm處吸光值。

1.2.9 RNA免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）實驗：獲取細胞裂解液，加入與磁珠耦聯(lián)的MSI2抗體（IgG作為對照），孵育，離心、漂洗后得到RNA/MSI2蛋白復合物，樣品加入蛋白酶K，震蕩孵育消化蛋白，然后提取沉淀的RNA。

1.2.10 甲基化RNA免疫沉淀（methylated RNA immunoprecipitation，MeRIP）實驗：獲取細胞裂解液，加入與磁珠耦聯(lián)的的METTL3甲基化抗體（IgG作為對照），孵育，離心、漂洗后得到RNA/METTL3蛋白復合物，樣品加入蛋白酶K，震蕩孵育消化蛋白，然后提取沉淀的RNA。

1.2.11 免疫印跡實驗：提取細胞中的總蛋白并進行定量。隨后應用SDS-PAGE分離蛋白質，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。然后，將膜用含有0.1% Tween 20（TBST）和5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽水封閉1 h，并在4 ℃下與相應的抗體孵育過夜。用TBST洗滌3次后，將膜與二抗在室溫下孵育。孵育后，通過圖像分析系統(tǒng)分析蛋白膜。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件行統(tǒng)計學分析。數(shù)據采用x-±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circFGGY在HepG2細胞中的表達及功能

如圖1A所示，與正常肝細胞相比，肝癌HepG2細胞中circFGGY的表達水平顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。如圖1B～1G所示，沉默circFGGY能顯著抑制HepG2細胞活力，上調HepG2細胞的ROS水平、脂質含量、鐵含量、線粒體超氧化物含量、GSH含量以及線粒體膜電位等鐵死亡生物學效應，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。

圖1 circFGGY在HepG2細胞中的表達和功能Fig.1 Expression and function of circFGGY in HepG2 cells

2.2 MSI2結合并促進circFGGY形成

如圖2所示，anti-MSI2洗脫液中的circFGGY較anti-IgG組顯著增多；與sh-NC組相比，沉默MSI2能夠顯著下調circFGGY的表達水平，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.01）。

圖2 MSI2結合并促進circFGGY形成Fig.2 MSI2 binds and promotes circFGGY formation

2.3 METTL3促進circFGGY m6A甲基化修飾并促進circFGGY出細胞核

MeRIP結果顯示，沉默METTL3可使circFGGY的m6A甲基化修飾水平顯著下調（P＜ 0.01，圖3A）。進一步應用免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn)，沉默METTL3導致細胞質中circFGGY RNA的表達水平顯著下調（圖3B）。

圖3 METTL3促進circFGGY m6A甲基化修飾并促進circFGGY出細胞核Fig.3 METTL3 promotes circFGGY m6A methylation modification and promotes circFGGY out of the nucleus

2.4 circFGGY 間接調控FSP1的表達

沉默circFGGY后，肝癌HepG2細胞中FSP1蛋白表達水平顯著下調（P＜ 0.01，圖4A）。進一步行RNA IP實驗發(fā)現(xiàn)，anti-FSP1洗脫液中circFGGY的富集程度無明顯變化（圖4B）。

圖4 circFGGY 間接調控FSP1的表達Fig.4 circFGGY indirectly regulates the expression of FSP1

3 討論

研究顯示，高表達的RNA結合蛋白MSI2通過與YAPmRNA結合調控mRNA降解，進而調控乳腺癌干細胞的干細胞性。人胃癌中，MSI2與c-MYCmRNA結合并增強其穩(wěn)定性，提高胃癌細胞的化療藥物耐藥性［17-18］。表明RNA結合蛋白MSI2具有與RNA結合的作用，而且MSI2的高表達發(fā)揮促癌作用。本研究組前期應用生物信息學軟件發(fā)現(xiàn)circFGGY基因兩端具有Alu元件，當Alu元件被結合激活后，可促進外顯子的結合拼接。并進一步預測到其序列存在MSI2的結合位點，還證實了MSI2可與circFGGY結合并調控其表達。這說明RNA結合蛋白MSI2可通過促進circFGGY的形成發(fā)揮其影響腫瘤功能的作用。

RNA，特別是circRNA的甲基化修飾是近年的研究熱點。RNA的m6A甲基化修飾參與細胞的多種分子調控過程。METTL14通過結合circORC5調控其m6A甲基化水平，進而調控其表達，發(fā)揮抑癌作用。本研究組前期應用生物信息學軟件發(fā)現(xiàn)circFGGY存在m6A甲基化修飾位點。本研究發(fā)現(xiàn)，METTL3可結合circFGGY并增加其m6A甲基化修飾水平，促進其出細胞核。FSP1是鐵死亡抑制因子，主要定位于細胞質，本研究結果顯示，沉默circFGGY能下調FSP1的表達水平，但二者并不存在直接結合作用，具體機制還有待進一步探索。

本研究結果顯示，MSI2、METTL3以及circFGGY在HepG2細胞中呈高表達，三者的沉默質粒轉染HepG2細胞可促進細胞鐵死亡，發(fā)揮促癌作用。circRNA及其甲基化修飾調控腫瘤細胞有氧糖酵解的機制極其復雜。MSI2、METTL3/circFGGY通過何種效應蛋白和途徑影響肝癌細胞鐵死亡的機制尚有待進一步研究探討。