王佳 許紅英 高峰★ 嚴(yán)士海

食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)制尚未明了［1］。反義泛素C 端水解酶L1（antisense ubiquitin carboxylterminal hydrolaseL 1，UCHL1 -AS1）是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），因與常規(guī)編碼基因泛素C 端水解酶L1（antisense Uchl1，UCHL1）互補(bǔ)而得名。研究顯示，上調(diào)UCHL1-AS1 可有效抑制肝癌細(xì)胞遷移［2］，增強(qiáng)雷帕霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7404 增殖的抑制作用［3］，但UCHL1-AS1 在食管癌中的表達(dá)及其對(duì)食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-629 是UCHL1-AS1的靶基因。miR-629 是肝癌［4］、宮頸癌［5］等腫瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)升高的微小RNA（microRNA，miRNA），對(duì)這些腫瘤的發(fā)展起促進(jìn)作用。但miR-629 對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。本研究旨在觀察UCHL1-AS1/miR-629 軸對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為食管癌發(fā)病機(jī)制的闡明及治療靶點(diǎn)的選擇提供新途徑。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年3 月至2020 年2 月于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的33 例食管癌患者食管癌組織及癌旁組織（距離原發(fā)灶＞3 cm，病理檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞），液氮保存。男19 例，女14 例，平均（57.3±8.24）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：初發(fā)食管癌；術(shù)前未行放化療、免疫治療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并慢性病者；合并血液系統(tǒng)疾病、自身免疫疾病等。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

Eca-109 細(xì)胞系，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清，美國(guó)Hycolne 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基、MTT、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國(guó)Invitrogen 公司；PCR 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒，大連寶生物；引物序列、UCHL1-AS1 過(guò)表達(dá)載體（pcDN3.1-UCHL1-AS1）、空載體（pcDNA3.1）、miR-629 抑制劑（anti-miR-629）、抑制劑陰性序列（antimiR-NC）、野生型（WT）和突變型（MUT）UCHL1-AS1 熒光素酶報(bào)告載體，上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)相關(guān)抗體，北京中杉。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR 檢測(cè)UCHL1-AS1 和miR-629 表達(dá)用RNA 提取試劑盒獲取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列：UCHL1-AS1 上游5′-AGG CCAGATGAGGAAACTG A-3′，下游5′-AAGGTGGACACCAGCTCATC-3′；miR-629 上 游5′-G TCGAAAGCTGCGCTGC GTGACGT-3′，下游5′-CGDTAGCGCGTDGCGGDGTCG-3′。 2-ΔΔCt法 計(jì) 算UCHL1-AS1 相 對(duì)GAPDH、miR-629 相對(duì)U6 的表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10 % FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)Eca-109 細(xì)胞。將Eca-109 細(xì)胞接種至6 孔板中，接種濃度為1×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉(zhuǎn)染pcDN3.1-UCHL1-AS1（pcDN3.1-UCHL1-AS1 組）、pcDN3.1（pcDN3.1組）、anti-miR-629（anti-miR-629 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、共轉(zhuǎn)染pcDN3.1-UCHL1-AS1 與anti-miR-NC（pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC組）、pcDN3.1 - UCHL1 - AS1 與anti - miR - 629（pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-629組），轉(zhuǎn)染時(shí)間6 h。RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞中UCHL1-AS1 或miR-629 表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后，將細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將六組細(xì)胞接種至96 孔板中，接種濃度為2.5×104個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h 后，加20 μL 5 g/L MTT，孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加150 μL 二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定吸光度值（A）。細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

遷移實(shí)驗(yàn)：將含8 μm 微孔聚碳酸酯膜的Transwell 小室置于24 孔板中，上室分別接種六組細(xì)胞，接種濃度為1.0×104個(gè)/孔。下室加500 μL 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，將下室細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：鋪Matrigel基質(zhì)膠于Transwell 上室，自然晾干后，再接種六組細(xì)胞，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 Western Blot 法 檢 測(cè)Ki67、N-cadherin 和E-cadherin 蛋白表達(dá)

將六組細(xì)胞接種至6 孔板中，接種濃度為1.0×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h 后，用RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)分離總蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4℃冰箱中，分別用Ki67（1∶1 000）、N-cadherin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶2 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育過(guò)夜，洗膜后，置于山羊抗兔二抗（1∶5 000）中，37℃孵育2 h。滴加顯液顯影，曝光拍照。

1.3.6 UCHL1-AS1 與miR-629 靶向關(guān)系驗(yàn)證

將Eca-109 細(xì)胞接種至6 孔板中，接種濃度為1×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-UCHL1-AS1 與miR-629 mimic（或miR-NC）、MUT-UCHL1-AS1 與miR-629 mimic（miR-NC），轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h。然后裂解細(xì)胞，以離心半徑10 cm、3 500 r/min 離心10 min 后，取上清液，分別加100 μL 螢火蟲(chóng)或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液，檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎的熒光強(qiáng)度。以螢火蟲(chóng)與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UCHL1-AS1 在食管癌中的表達(dá)

食管癌組織UCHL1-AS1 表達(dá)低于癌旁組織［（0.18±0.03）vs（1.02±0.05）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=82.755，P＜0.05）。

圖1 UCHL1-AS1在食管癌組織中的表達(dá)（DAB顯色，×400）Figure 1 Expression of UCHL1-AS1 in esophageal cancer tissue（DAB color，×400）

2.2 UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

pcDN3.1-UCHL1-AS1 組Eca-109 細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、Ki67 蛋白及N-cadherin 蛋白水平均低于pcDN3.1 組；UCHL1-AS1、E-cadherin 蛋白水平高于pcDN3.1 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

表1 UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 1 Effects of UCHL1-AS1 on proliferation，migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

表1 UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 1 Effects of UCHL1-AS1 on proliferation，migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

組別pcDN3.1-UCHL1-AS1 組pcDN3.1 組t 值P 值n33 UCHL1-AS1 3.23±0.08 1.00±0.05 70.914＜0.001細(xì)胞存活率（%）52.29±6.13 100.00±8.17 14.013＜0.001遷移數(shù)（個(gè)）79.00±5.05 164.00±7.92 27.148＜0.001侵襲數(shù)（個(gè)）46.00±3.41 98.00±5.10 25.428＜0.001 Ki67 蛋白0.20±0.02 0.78±0.05 32.311＜0.001 N-cadherin 蛋白0.15±0.02 0.67±0.04 34.883＜0.001 E-cadherin 蛋白0.60±0.04 0.21±0.02 26.262＜0.001

圖2 UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect UCHL1-AS1 on the migration，invasion and expression of related proteins in Eca-109 cells

2.3 UCHL1-AS1 靶向負(fù)調(diào)控miR-629 表達(dá)

共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-UCHL1-AS1 與miR-629 mimics的細(xì)胞熒光素酶活性低于WT-UCHL1-AS1 與miR-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.19±0.02）vs（0.95±0.05），t=42.339，P＜0.05］；共轉(zhuǎn)染MUT-UCHL1-AS1 與miR-629 mimics、MUT-UCHL1-AS1 與miRNC 細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.97±0.05）vs（0.96±0.05），t=0.424，P=0.677］。與pcDN3.1 組比較，pcDN3.1-UCHL1-AS1 組Eca-109 細(xì)胞中UCHL1-AS1 表達(dá)水平升高，miR-629表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 UCHL1-AS1 靶向負(fù)調(diào)控miR-629 表達(dá)（±s）Table 2 Expression of miR-629 negatively regulated by UCHL1-AS1 targeting（±s）

表2 UCHL1-AS1 靶向負(fù)調(diào)控miR-629 表達(dá)（±s）Table 2 Expression of miR-629 negatively regulated by UCHL1-AS1 targeting（±s）

組別pcDN3.1-UCHL1-AS1 組pcDN3.1 組t 值P 值n33 UCHL1-AS1 3.21±0.07 1.02±0.05 44.095＜0.001 miR-629 0.25±0.03 0.99±0.05 38.073＜0.001

2.4 下調(diào)miR-629 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

anti-miR-629 組Eca-109 細(xì)胞中的miR-629、細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及Ki67 蛋白和N-cadherin 蛋白水平均低于anti-miR-NC 組；E-cadherin 蛋白高于anti-miR-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

圖3 下調(diào)miR-629 對(duì)Eca-109 細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of down-regulated miR-629 on migration，invasion and related protein expression of Eca-109 cells

表3 下調(diào)miR-629 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of down-regulation of miR-629 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

表3 下調(diào)miR-629 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of down-regulation of miR-629 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

組別anti-miR-629 組anti-miR-NC 組t 值P 值n33 miR-629 0.21±0.02 1.02±0.05 45.124＜0.001細(xì)胞存活率（%）56.52±6.51 100.02±8.15 12.511＜0.001遷移數(shù)（個(gè)）87.00±5.37 165.00±7.93 24.433＜0.001侵襲數(shù)（個(gè)）56.00±3.83 99.00±5.14 20.125＜0.001 Ki67 蛋白0.31±0.03 0.79±0.05 24.696＜0.001 N-cadherin 蛋白0.24±0.03 0.68±0.04 26.400＜0.001 E-cadherin 蛋白0.51±0.04 0.22±0.02 19.454＜0.001

2.5 下調(diào)miR-629 可增強(qiáng)UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-629 組Eca-109細(xì)胞中的miR-629、細(xì)胞存活率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及Ki67 蛋白和N-cadherin 蛋白均低于pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC 組；E-cadherin 蛋白高于pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表4、圖4。

圖4 下調(diào)miR-629 增強(qiáng)UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Down-regulating miR-629 enhanced the effect of UCHL1-AS1 on migration，invasion and expression of related proteins in Eca-109 cells

表4 下調(diào)miR-629 可增強(qiáng)UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 4 Down-regulation of miR-629 can enhance the effects of UCHL1-AS1 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

表4 下調(diào)miR-629 可增強(qiáng)UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 4 Down-regulation of miR-629 can enhance the effects of UCHL1-AS1 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

組別pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-629 組pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC 組t 值P 值n 33 miR-629 0.35±0.03 0.99±0.05 32.928＜0.001細(xì)胞存活率（%）34.68±3.18 52.27±5.26 4.957 0.008遷移數(shù)（個(gè)）52.00±3.65 80.00±5.11 13.376＜0.001侵襲數(shù)（個(gè)）28.00±2.46 47.00±3.44 13.478＜0.001 Ki67蛋白0.06±0.01 0.21±0.02 20.125＜0.001 N-cadherin蛋白0.03±0.01 0.17±0.02 17.441＜0.001 E-cadherin蛋白0.93±0.06 0.61±0.04 13.313＜0.001

3 討論

LncRNA 為長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的分子非編碼RNA，可發(fā)揮miRNA 分子海綿作用調(diào)控靶基因的表達(dá)，LncRNA/miRNA/靶基因這一調(diào)控通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前已報(bào)道多種LncRNA 在食管癌中異常表達(dá)，為食管癌發(fā)病機(jī)制闡明及治療靶點(diǎn)選擇提供了新途徑［6］。UCHL1-AS1 作為近年新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，與UCHL1 基因互補(bǔ)，且二者呈正調(diào)控的關(guān)系。Carrier團(tuán)隊(duì)［7］通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)UCHL1-AS1 小鼠神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性、外源性UCHL1 蛋白表達(dá)量均增加。并且在雷帕霉素作用下，UCHL1-AS1 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿的同時(shí)，UCHL1 蛋白表達(dá)同樣呈增加狀態(tài)。UCHL1 蛋白具有抑癌或促癌的雙向調(diào)節(jié)作用，而閆文姬等［8］的研究表明，UCHL1 蛋白受啟動(dòng)子區(qū)高甲基化調(diào)控呈低表達(dá)，從而參與了食管癌變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前UCHL1-AS1 在食管癌中的研究才剛起步，其對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展的影響和機(jī)制還未知，因此本研究特對(duì)此展開(kāi)探究。

本研究結(jié)果顯示，食管癌組織UCHL1-AS1 表達(dá)明顯低于癌旁組織，上調(diào)UCHL1-AS1 導(dǎo)致食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力受到抑制，提示UCHL1-AS1 作為抑癌基因參與食管癌的進(jìn)展過(guò)程，可作為食管癌治療的分子靶點(diǎn)。Ki67 是一種與細(xì)胞增殖特異相關(guān)的核蛋白，與核糖體RNA 的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，其表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞增殖［9］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的主要機(jī)制之一，主要特點(diǎn)是上皮型鈣黏蛋白E-cadherin 表達(dá)降低，而神經(jīng)型鈣黏N-cadherin 表達(dá)升高［10-11］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，上調(diào)UCHL1-AS1 表達(dá)降低了Eca-109細(xì)胞中Ki67 和N-cadherin 蛋白表達(dá)，但促進(jìn)了E-cadherin 蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明上調(diào)UCHL1-AS1抑制Eca-109 細(xì)胞的惡性行為。

此外，本研究證實(shí)了UCHL1-AS1 靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-629 表達(dá)。miR-629 是一個(gè)在多種腫瘤中異常表達(dá)的miRNA。miR-629 在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-629 降低胃癌細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-629 可能是胃癌的治療 靶 標(biāo)［12］；胰 腺 癌 中miR-629 表 達(dá) 上 調(diào)，下 調(diào)miR-629 表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)FOXO3 抑制胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移［13］；卵巢癌組織中miR-629 上調(diào)，上調(diào)miR-629 表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，并抑制細(xì)胞凋亡［14］。本研究顯示，下調(diào)miR-629 表達(dá)可有效抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且可增強(qiáng)UCHL1-AS1 對(duì)Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示UCHL1-AS1 可能通過(guò)靶向下調(diào)miR-629 表達(dá)發(fā)揮抗食管癌作用，但UCHL1-AS1 具體作用于miR-629 的靶基因還有待進(jìn)一步探究。

綜上，UCHL1-AS1 在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)UCHL1-AS1 導(dǎo)致食管癌Eca-109 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，這可能與上調(diào)UCHL1-AS1 導(dǎo)致細(xì)胞中miR-629 表達(dá)降低有關(guān)。接下來(lái)，本研究將進(jìn)一步探討UCHL1-AS1 影響食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的其他作用機(jī)制及對(duì)移植瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，以期為食管癌的靶向分子治療提供新途徑。