張建海 王巍 王前 許佳倫 高娜

肺癌是國內(nèi)第一大癌癥疾病，死亡率也位居所有癌癥之首，5 年以上存活率僅18%［1］。由于肺癌患者早期癥狀普遍不明顯，實驗室指標也不具特異性，導致肺癌臨床診斷存在一定困難，目前臨床對于肺癌的診斷主要通過影像學及病理學檢查，其中以病理活檢診斷準確率最高，是診斷肺癌及其分型的金標準，但該診斷方式具有有創(chuàng)性，臨床應(yīng)用存在一定的局限性［2］。環(huán)狀RNA（circular-RNA，circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNAs），其在生物體內(nèi)含量較為豐富，主要由mRNA 前體（pre-mRNA）經(jīng)反向剪接環(huán)化而形成，具有穩(wěn)定性、保守性、普遍性、組織和疾病特異性的特點，有望成為一種癌癥診斷及預(yù)后的生物學標志物［3］。近年來，相關(guān)文獻報道了circRNA 應(yīng)用于胃癌、乳腺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種癌癥診斷及患者預(yù)后評估方面的價值［4-5］。本實驗對肺腺癌患者組織中差異性表達的環(huán)狀RNA 進行篩選及驗證，以初步探討MiR-129-5p 作為肺腺癌早期診斷分子生物標志物的價值。

1 對象與方法

1.1 臨床標本

收集2014 年1 月至2017 年1 月年度北京市大興區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的50 例肺腺癌病人的外周血液樣本10 mL（肺腺癌組），同時選取門診體檢的健康志愿者30 名（健康對照組），抽取外周血液10 mL。肺腺癌患者，納入標準：術(shù)中、醫(yī)院病理學檢查確診為浸潤性腺癌，排除標準：①病理學診斷為非腺癌或混合型癌，依據(jù)第八版腫瘤TNM 分期標準進行腫瘤分期；②在采血之前，接受過任何手術(shù)、化療、放療；③合并肺結(jié)核、高血壓、冠心病等基礎(chǔ)疾病；④病歷資料不完全?；颊呔炇鹬橥鈺?，本研究通過了北京市大興區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的倫理委員會批準。

1.2 樣品收集

抽取患者10 毫升血液并放置于三個試管中；其中一個含有用于全血細胞計數(shù)（Whole blood cell count，WBC）的 乙 二 胺 四 乙 酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），第二個含有用于凝血酶原時間（prothrombin time，PT）測量的檸檬酸鈉，第三個離心管用于血清分離。血清用于測定所有血清學測試，包括ELISA 和分子生物學技術(shù)。

1.3 RNA 提取

使用Qiagen（Valenica，CA）試劑盒從血清中提取RNA。RNA 濃度由NanoDrop2000（ThermoScientific）測定。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

使用Qiagen 通過RT-PCR 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用miScriptSYBRGreenPCRKit（Qiagen）試劑盒通過實時RT-PCR 擴增cDNA 模板。使用轉(zhuǎn)子基因QSystem（Qiagen）進行定量PCR（qPCR）。而MiR-129-5p 的基因表達被標準化 為SNORD68 表 達。通 過2-δδCt 方 法 計 算RNA 的相對表達。MiR-129-5p 的引物由德國Qiagene 公司提供。用于擴增NEAT1 基因表達的引物是（776716R5485）：正向50-TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG-30 和反向50-TGAAAACCTTTACCCCAGGA-30（Invitrogen）。

1.5 定量實時PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol 試劑從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA。 使 用 總 RNA 用 cDNA 合 成 試 劑 盒（FastQuantRT 試劑盒，中國北京天根）合成cDNA。根據(jù)制造商的建議，使用SuperRealPreMixPlus（天根）進行qRT-PCR。用于qRT-PCR 的所有引物的序列列于補充表1。所有實驗均以三份形式進行。β-actin 和U6 表達分別用于mRNA 和MiR-129-5p 表達的正常化。使用2-ΔΔCt 方法確定了相對表達水平。

1.6 隨訪

術(shù)后追蹤病人全部經(jīng)門診或電話追蹤，直至2022 年1 月份，并進行5 年的整體生存統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 兩組MiR-129-5p 表達水平比較

肺腺癌組MiR-129-5p（0.92±0.06）的表達水平低于對照組（0.18±0.07），比較差異有統(tǒng)計學意義（t=48.215，P＜0.001）。見圖1。

2.2 MiR-129-5p 表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

MiR-129-5p 表達與肺腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、年齡（＞60 歲與＜60 歲）、TNM 分期、浸潤深度、表皮生長因子受體（Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）基因突變有關(guān)（P均＜0.05），與患者性別、吸煙與否、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 MiR-5129-55p 表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between MiR-5129-55p expression and clinicopathological features of patients with lung adenocarcinoma

2.3 生存分析顯示

以肺腺癌血清中MiR-129-5p 表達的中位數(shù)為基準，將肺腺癌分為高、低表達組。MiR-129-5p 高表達組5 年總生存率高于MiR-129-5p 低表達組（P＜0.05）。Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM 分期、浸潤深度和MiR-129-5p 表達是肺腺癌患者預(yù)后的獨立風險因素。見圖2、表2。

圖2 MiR-129-5p高低表達肺腺癌患者5年生存率K-M 分析Figure 2 K-M analysis of 5-year survival rate of patients with high and low expression of MiR-129-5p in lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者預(yù)后的風險因素分析Table 2 Analysis of prognostic risk factors in patients with lung adenocarcinoma

圖2 MiR-129-5p 相關(guān)的ROC 曲線Figure 2 The ROC curve of MiR-129-5p

2.4 MiR-129-5p 對肺腺癌的診斷效率

通過繪制ROC 曲線（n=80），包括肺腺癌組=50 例，健康對照組=30 例，MiR-129-5p 診斷肺腺癌的敏感性為65.6%，特異性為75.0%，AUC=0.751，P=0.002，臨 界 值0.452，95%CI為0.613～0.887。

3 討論

肺腺癌是原發(fā)性肺癌較為常見的一種亞型，其屬于腺上皮惡性腫瘤，具有眾多的組織學分類，可以以腺泡、細支氣管肺泡、乳頭等形式存在。有研究報道，腫瘤標志物的水平高低可以預(yù)測瘤體的大小和TNM 分期［6］。此外，首次診斷或治療前升高的標志物水平也可以用于監(jiān)測后續(xù)的治療效果和預(yù)后判斷。

隨著基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，近年來越來越多不具備蛋白質(zhì)編碼功能的RNA 被發(fā)現(xiàn)。MiRNA 是一類長19～25 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，多位于腫瘤相關(guān)的脆性位點或基因區(qū)域，其能夠與具備蛋白質(zhì)編碼功能的信使RNA 結(jié)合廣泛參與腫瘤病理生理過程［7-8］。MiR-129-5p 由MiR-129-1 和MiR-129-2 協(xié)同轉(zhuǎn)錄而成，近年來，有研究報道［9］顯示，MiR-129-5p 可在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。在胃癌中，miR-129-5p 可通過靶向白細胞介素-8 參與胃癌細胞的遷移和入侵。在乳腺癌中，miR-129-5p 通過靶向HMGB1 來減弱輻照誘導自噬，并降低乳腺癌細胞的輻射抵抗力；miR-129-5p 是腫瘤生長的抑制劑。但在喉癌組織中MiR-129-5p 表達則顯著上調(diào)，其主要是通過靶向作用于含WW 結(jié)構(gòu)域的E3 泛素蛋白連接酶1 而促進癌細胞增殖和浸潤。MiR-129-5p 在肺癌組織中表達顯著下調(diào)，其主要通過靶向抑制肺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子的生成而發(fā)揮對癌細胞遷移和侵襲能力的抑制作用。MiR-129-5p 在肝癌組織中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可提升其對鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶4 的調(diào)節(jié)作用，進而進一步起到對癌細胞增殖、遷移、浸潤的抑制作用［10-11］。本研究結(jié)果提示，MiR-129-5p 在肺腺癌細胞中表達顯著下調(diào)，明顯低于健康對照組患者，由此推測，MiR-129-5p 與肺腺癌疾病發(fā)生、進展、預(yù)后可能存在某種關(guān)系，可通過調(diào)控下游靶基因，從而發(fā)揮促癌或抑癌的作用，具有成為診斷肺腺癌的生物標志物潛力。

進一步驗證其在肺腺癌血液中表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性及對肺腺癌診斷效率分析。研究發(fā)現(xiàn)，擴大樣本量進行qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)，MiR-129-5p 表達水平與肺腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、年齡、TNM 分期、浸潤深度、EGFR 基因突變有關(guān)，但在患者性別、吸煙與否、腫瘤大小未見顯著性差異。它與分化程度呈負相關(guān)，分化程度越高，表達水平就越低，這表明miR-129-5p在肺腺癌的發(fā)生和進展中起著重要作用。此外，它與TNM 分期、浸潤深度、EGFR 基因突變呈負相關(guān)；表達水平越低，疾病的嚴重程度就越高，這表明miR-129-5p 可用于判斷疾病的嚴重程度。

胡俊華等［12］發(fā)現(xiàn)MiR-129-5p 可能成為結(jié)腸癌新的治療靶點。MiR-129-5p 表達可能會對腫瘤化療敏感性產(chǎn)生影響。Lu 等［13］發(fā)現(xiàn)，MiR-129-5p 通過下調(diào)RpS6，使Her-2 陽性乳腺癌對曲妥珠單抗過敏。Ma 等［14］研究報告稱，MiR-129-5p 通過直接靶向DLK1 來抑制NSCLC 和化療耐藥性。Zeng等［15］發(fā)現(xiàn)，microRNA-129-5p 通過靶向SOX2 抑制乳腺癌中的阿霉素耐藥性?；谏鲜鲅芯浚覀兛梢源_認MiR-129-5p 可能成為肺腺癌預(yù)后的潛在生物標志物，但MiR-129-5p 在肺腺癌中的作用機制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)MiR-129-5p 低表達患者的5 年存活率明顯下降，預(yù)后不佳。此外ROC 曲線提示MiR-129-5p 對肺腺癌的診斷準確度高，這表明MiR-129-5p 相對表達水平對評估肺腺癌診斷、預(yù)后和癌癥治療療效具有重要價值。

本研究從表達水平、與臨床病理特征、預(yù)后關(guān)系等多方面研究了miR-129-5p 在肺腺癌患者血液中的表達水平，為臨床研究提供了參考。但研仍存在一些局限性，僅側(cè)重于血清學以探索其價值，過于單一。且由于肺腺癌5 年以上存活率低，隨訪時間短，加上治療差異，miR-129-5p 與肺腺癌患者長期生存預(yù)后之間的關(guān)旭仍需進一步研究?？傊?，肺腺癌組織中MiR-129-5p 低表達，其表達變化與肺腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)；血清MiR-129-5p 可用作肺腺癌癌癥診斷和預(yù)后的潛在生物標志物。