張志敏 張永梅 劉鑫艷 潘志蘭

急性白血病（Acute leukemi，AL）是造血干細(xì)胞的惡性克隆疾病，在發(fā)病過(guò)程中骨髓中異常細(xì)胞大量繁殖，使正常造血受到影響，且髓外臟器也受到浸潤(rùn)［1］。近年來(lái)，隨著造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展及新藥的研發(fā)，治療AL 患者的效果有了較大提升，但5 年的存活率只達(dá)到約30%，且≥65 歲老年人群多因化療方案耐藥引起復(fù)發(fā)，導(dǎo)致死亡率較高，并且近年來(lái)死亡率仍未明顯下降［2］。為此，需尋找更多新的生物標(biāo)志物，以識(shí)別高危患者并成為治療新靶點(diǎn)。獨(dú)立生長(zhǎng)因子1B（growth factor-independent 1B，GFI1B）屬一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，位于人類基因組9q34.13，主要表達(dá)于胎兒、成人的紅細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系，是兩系生成和分化過(guò)程中一種必需的轉(zhuǎn)錄因子，GFI1B 表達(dá)與急性白血病、T 細(xì)胞淋巴瘤、重型再生障礙性貧血等疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)［3］。然而，有關(guān)GFI1B 表達(dá)在AL 患者中的作用尚未明確。本研究旨在探討GFI1B 表達(dá)與AL 患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床應(yīng)用提供理論支持，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018 年1 月至2020 年12 月石家莊市人民醫(yī)院收治的86 例AL 患者為研究對(duì)象，男性48例，女性38 例，平均年齡（41.27±4.21）歲；另選取同期在本院進(jìn)行體檢的健康者30 名為對(duì)照組，男性19 例，女性11 例，平均年齡（39.58±4.08）歲。兩組性別、年齡對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AL 患者由臨床、血常規(guī)檢查、骨髓象確診［4］；②臨床資料完整者；③研究對(duì)象及家屬知情同意并自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他血液系統(tǒng)疾?。虎诤喜盒阅[瘤者；③妊娠期或哺乳期女性。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清GFI1B 表達(dá)檢測(cè)

1.2.1.1 儀器及試劑 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 儀（Real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，PQ-PCR，公司：美國(guó)PE 公司；型號(hào)：ABI-5700）檢測(cè)并動(dòng)態(tài)觀察GFI1B 表達(dá)；PQ-PCR 引物合成、熒光探針合成、PQ-PCR 用dNTP、5×PQ-PCR buffer 于廣東達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心購(gòu)買，PCR 引物合成在北京賽百盛公司購(gòu)買。

1.2.1.2 檢測(cè)方法 ①細(xì)胞分離及提取總RNA：抽取兩組新鮮外周血4 mL，107 U/L 肝素抗凝，加4 mL Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液，2 000 rpm 轉(zhuǎn)速離心20 min（離心半徑10 cm）分離單個(gè)核細(xì)胞，用0.9%氯化鈉注射液清洗3 次。采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA，1g/L 瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀顯示28S 和18S 兩條清晰條帶，顯示提取完整的RNA。②cDNA 合成：逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL，包括細(xì)胞總RNA 1 μg，隨機(jī)引物500 ng，RNA 酶抑制劑25 U，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μL，MMLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶200 U。37℃、60 min，94℃、5 min，1℃、2 min 終止反應(yīng)。③GFI1B 正向引物：5′-TCTGGCCTCCTGCCCTTAC-3′；GFI1B 反向引物：5-CCGGCTCTCGTTTGAGGTT-3′，GFI1B 探針序列：5′-FAM-CCGGTGCCCAGAGAC-CAGGCTAMRA-3′GFI1B 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為117 bp。④PQPCR 反應(yīng)：待測(cè)樣本和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：反應(yīng)體系50 μL，包括5×定量PCR buffer 10 μL，上游引物F（10 pmol/μL）1 μL，下游引物R（10 pmol/μL）1 μL，探 針（5 pmol/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq 酶（3 U/μL）1 μL，cDNA 或陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1 μL，ddH2O34 μL。擴(kuò)增條件：93℃、3 min，93℃、30 s，55℃、45 s，共40 個(gè)循環(huán)。 ⑤定量分析產(chǎn)物：反應(yīng)結(jié)束后，隨機(jī)選擇5 個(gè)陽(yáng)性模板標(biāo)準(zhǔn)梯度點(diǎn)分析，若相關(guān)系數(shù)r2＞0.97，表明線性關(guān)系較好，可確定為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣本熒光定量反應(yīng)的絕對(duì)定量值，即為目的基因的表達(dá)水平。將GFI1B 表達(dá)≥0.5×106拷貝/μL cDNA 定義為高表達(dá)［5］。

1.2.2 資料的收集

通過(guò)查閱病歷獲得患者的臨床資料，包括性別、年齡、疾病類型、危險(xiǎn)度分型、白細(xì)胞、髓外浸潤(rùn)、查爾森合并癥指數(shù)（Charlson Comorbidity Index，CCI）評(píng)分［6］。

對(duì)觀察組進(jìn)行為期1 年的隨訪，隨訪形式包括電話隨訪、門診復(fù)診。以患者死亡為終點(diǎn)事件，本研究隨訪截止時(shí)間為2021 年12 月31 日，以了解AL 患者的預(yù)后情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 21.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用（±s）表示，組間行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，AL 患者中GFI1B 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，建立Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析GFI1B 表達(dá)與AL 患者預(yù)后的關(guān)系；采用Kaplan-Meier 法設(shè)計(jì)生存曲線，并用Log-Rank 法比較組間的生存差異。當(dāng)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組GFI1B 表達(dá)水平比較

觀察組患者的GFI1B 表達(dá)水平（0.78±0.11）高于對(duì)照組（0.06±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=34.707，P＜0.05）。

2.2 GFI1B 高表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

AL 患者中GFI1B 高表達(dá)與危險(xiǎn)度分型、白細(xì)胞有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 GFI1B 高表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 1 Relationship between GFI1B overexpression and clinicopathological features［n（%）］

2.3 影響AL 患者預(yù)后的單因素分析

本研究AL 患者的1 年總生存率為59.30%（51/86）。單因素分析顯示，髓外浸潤(rùn)、CCI 評(píng)分、GFI1B 表達(dá)均是影響AL 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 影響AL 患者預(yù)后的單因素分析［n（%）］Table 2 Univariate analysis of influencing prognosis of AL patients［n（%）］

2.4 影響AL 患者預(yù)后的Cox 分析

以AL 患者預(yù)后為因變量進(jìn)行Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示，髓外浸潤(rùn)、CCI 評(píng)分、GFI1B 表達(dá)均是AL 患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。GFI1B 高表達(dá)組（56.52%）1 年生存率低于GFI1B低表達(dá)組（88.24%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 GFI1B 表達(dá)與AL 患者1 年生存率的關(guān)系Figure 1 Relationship between GFI1B expression and 1 year survival rate of AL patients

表3 影響AL 患者預(yù)后的Cox 分析Table 3 Cox analysis of influencing prognosis of AL patients

3 討論

AL 是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，主要表現(xiàn)為白血病細(xì)胞增殖、分化和凋亡異常，而正常的造血功能受到影響。目前，臨床上治療AL 患者主要是最大限度消滅白血病細(xì)胞群體，抑制白血病細(xì)胞的異常增殖，同時(shí)對(duì)因白血病細(xì)胞浸潤(rùn)而引起的各種臨床表現(xiàn)可有效緩解。盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)在不斷地發(fā)展，但AL 患者仍存在較高的病死率。因此，急需尋找更多新的生物標(biāo)志物來(lái)作為患者預(yù)后標(biāo)志物及治療新靶點(diǎn)。GFI1B 是在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的與GFI1 結(jié)構(gòu)十分相似的一種核轉(zhuǎn)錄抑制因子，同時(shí)也是紅系、巨系生成和分化過(guò)程中的一種必需轉(zhuǎn)錄因子［7］。GFI1B 表達(dá)與AL、T 細(xì)胞淋巴瘤、重型再生障礙性貧血等疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，但其表達(dá)對(duì)AL 患者的臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

本研究采用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)AL 患者和健康體檢者的GFI1B 表達(dá)情況，結(jié)果顯示，觀察組患者的GFI1B 表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示GFI1B 異常高表達(dá)與AL 的發(fā)生密切相關(guān)，與既往研究相符［8］。AL 是造血干細(xì)胞的異常增殖所致，且是一個(gè)多步驟多基因參與的過(guò)程，故治療該疾病的首要步驟是控制細(xì)胞生長(zhǎng)的基因表達(dá)異?；蚱渚幋a蛋白功能異常［9］。調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)化常以轉(zhuǎn)錄因子形式進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后使細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控非正常，而GFI1B 屬該類因子的一種［10］。GFI1B 一旦發(fā)生過(guò)度表達(dá)，可通過(guò)激活一系列細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)從而抑制細(xì)胞的凋亡及促進(jìn)細(xì)胞的增殖的作用，進(jìn)而使腫瘤惡性發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)GFI1B 高表達(dá)與危險(xiǎn)度分型、白細(xì)胞有關(guān)。GFI1B 是一種鋅指蛋白，具有轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能，對(duì)于產(chǎn)生確定的紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞譜系至關(guān)重要［11］?？赡苡捎贕FI1B 對(duì)造血分化的表觀遺傳調(diào)控取決于輔因子CoREST 和LSD1，在GFI1B 的SNAG 結(jié)構(gòu)域之間的相互作用介導(dǎo)的過(guò)程中，這些輔因子被募集到GFI1B 靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制這一過(guò)程會(huì)干擾紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞的分化［12］。Cox 回歸分析顯示，髓外浸潤(rùn)、CCI 評(píng)分、GFI1B 表達(dá)均為AL 患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。結(jié)果提示AL 患者的GFI1B 表達(dá)異常，可能會(huì)促進(jìn)疾病的惡性進(jìn)展，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，也表明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)GFI1B 對(duì)AL患者預(yù)后有著重要的指導(dǎo)意義。有研究顯示［13］，缺乏GFI1B 的小鼠不能生成成熟的紅細(xì)胞，而在這些小鼠的肝臟中紅系和巨核系生成的前體物質(zhì)增多，這表明GFI1B 在紅系和巨核系的生成和分化中起了重要的作用。當(dāng)患者出現(xiàn)髓外浸潤(rùn)時(shí)，腫瘤負(fù)荷較高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞清除較慢，雖在治療后可得到緩解，但復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，且影響預(yù)后［14］。CCI 評(píng)分≥2 分是AL 患者預(yù)后不良獨(dú)立影響因素，可能是由于患者常合并心、肝、肺等重要器官功能障礙，嚴(yán)重性的合并癥會(huì)降低機(jī)體對(duì)藥物清除力以及影響機(jī)體抵抗力［15］。另有研究表示，GFI1B 表達(dá)不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期依賴激酶抑制物p2l Wafl/Cip 的產(chǎn)生及表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞滯留在G0 期，且還可與GFl1 基因相互作用使細(xì)胞癌變，因此GFI1B 高表達(dá)會(huì)增加AL 患者病死率風(fēng)險(xiǎn)［16］。

綜上所述，GFI1B 在AL 患者中呈高表達(dá)態(tài)，其表達(dá)異常升高會(huì)增加預(yù)后的死亡風(fēng)險(xiǎn)，GFI1B參與調(diào)節(jié)AL 的發(fā)生及發(fā)展，可作為AL 患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。此外，臨床可加強(qiáng)對(duì)AL 患者GFI1B 的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以提高患者的生存率。本研究還存在不足之處，樣本量較少，未來(lái)需開(kāi)展大病例數(shù)進(jìn)一步研究。