司亞靜 張建麗 鄭雪莉

口腔癌作為常見的惡性腫瘤，其生存率較低［1］，近年來，口腔癌的發(fā)病機(jī)制和治療取得了很大進(jìn)展，患者通過手術(shù)、放療和激光方法進(jìn)行治療，但是口腔癌細(xì)胞易向頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［2］。由于預(yù)后較差，進(jìn)一步開展口腔癌的研究具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA 超過200 個(gè)核苷酸，參與基因表達(dá)［3-4］和癌細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控［5］，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［6-7］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA 肝細(xì)胞核因子1α反義鏈1（LncRNA HNF1A-AS1，HNF1A-AS1）是一個(gè)新的單外顯子基因，含有2 455 個(gè)核苷酸，參與多種癌癥的進(jìn)展。Fang 等［8］發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1通過微小RNA-34a（miRNA-34a，miR-34a）/SIRT1/p53反饋環(huán)促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。另有研究顯示，HNF1A-AS1能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖［9］。然而，HNF1-AS1在口腔癌中的潛在機(jī)制仍不清楚。本研究主要評(píng)估HNF1-AS1在口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并研究了其對(duì)口腔癌細(xì)胞體外增殖與轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從上海生物細(xì)胞研究所選購(gòu)口腔癌細(xì)胞（HSC-6 細(xì)胞）和正?？谇簧掀そ琴|(zhì)細(xì)胞（HOK 細(xì)胞）（貨號(hào)：12634010，500 mL），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連Takara 公司（貨號(hào)：RR036A，200 Rxns），Lipofectamine 2000 購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾科技公司（貨號(hào)：11668027，0.75 mL），MTT 試劑盒及其DMSO試劑購(gòu)自上海碧云天（貨號(hào)：C0009S，500 Rxns），DMSO 試劑購(gòu)自上海碧云天（貨號(hào)：ST1276，100 mL）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 購(gòu)自西安天隆科技有限公司（型號(hào)：Gentier 48E），細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司（型號(hào)：D180）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

HSC-6 細(xì)胞和HOK 細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HNF1A-AS1下調(diào)和過表達(dá)質(zhì)粒、miR-320d模擬物及其抑制劑由北京擎科生物有限公司合成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是使用Lipofectamine 2000 按照制造商的說明進(jìn)行的。細(xì)胞分為①siRNA NC、HNF1AAS1siRNA、PBX3 siRNA 組；②HNF1A-AS1wt+mimics control、HNF1A-AS1 wt+miR-320d、HNF1AAS1mut+mimics control、HNF1A-AS1mut+miR-320d組；③inhibitor NC、miR-320dinhibitor 組；④pcDNA-3.1（+）、pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1、pcDNA-3.1（+）+mimics NC、miR-320dmimics+pcDNA-3.1（+）、pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1+miR-320dmimics 組；⑤PBX3wt+mimics control、PBX3wt+miR-320d、PBX3mut+mimics control、PBX3mut+miR-320d組；⑥siRNA NC+inhibitor NC、HNF1AAS1siRNA+inhibitor NC、siRNA NC+miR-320dinhibitor、HNF1A-AS1siRNA+miR-320dinhibitor 組。轉(zhuǎn)染成功后，分別處理細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定

轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔5×103的密度置在96 孔板中。48 小時(shí)后，添加MTT 工作液。孵育4 小時(shí)后，取150 μL 二甲基亞砜加入其中，讀取540 nm波長(zhǎng)下的光密度值。

1.2.4 免疫印跡

提取總蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后再轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂奶粉封膜，與特異性一抗和二抗孵育，使用電化學(xué)發(fā)光觀察蛋白條帶。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

細(xì)胞總RNA 提取后，反轉(zhuǎn)成互補(bǔ)DNA，通過定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定基因表達(dá)量。引物如下：GAPDH-F：ACAGTCAGCCGCATCTTCTT；GAPDH- R：GACAAGCTTCCCGTTCTCAG；HNF1A-AS1-F：TCAAGAAATGGTGGCTAT；HNF1A-AS1-R：GATCTGAGACTGGCTGAA；miR-320d- F：ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA；miR-320d-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCTCTCA；PBX3-F：AGA CGGGAGCTCATCAATCAGACGGGAGGCTAC；PBX3-R：AGAATAAAGCTTCATTAGAATCACCGCCACAA。

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

HNF1A-AS1及miR-320d靶基因分析后，構(gòu)建HNF1A-AS1wt 和PBX3wt 載體。使用點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建HNF1A-AS1和PBX3突變質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，最后分析測(cè)定熒光素酶活性。

1.2.7 細(xì)胞侵襲

matrigel 過夜融化后加入空DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋（1 mg/mL），取100 μL 加入上室并干成膠狀。細(xì)胞匯合達(dá)95%時(shí)，2.5 g/L 的胰酶消化，小室中加入細(xì)胞懸液，下室加入DMEM，培養(yǎng)一短時(shí)間后進(jìn)行固定和染色，并觀察與記數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；用單因素方差進(jìn)行多組間比較，LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)HNF1A-AS1 表達(dá)對(duì)HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 的影響

與HOK 細(xì)胞相比，HSC-6 細(xì)胞中HNF1AAS1表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1A。與siRNA 組相比，HNF1A-AS1siRNA組細(xì)胞內(nèi)HNF1A-AS1表達(dá)降低，HNF1A-AS1siRNA 組細(xì)胞增殖活力下調(diào)，HSC-6 細(xì)胞侵襲數(shù)目減少，N-cadherin 表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖1B～1G。

圖1 下調(diào)HNF1A-AS1 表達(dá)抑制了HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMTFigure 1 Down-regulation of HNF1A-AS1 expression inhibited the proliferation，invasion and EMT of HSC-6 cells

2.2 HNF1A-AS1 與miR-320d 的靶向關(guān)系

HNF1A-AS1與其靶基因miR-320d的結(jié)合位點(diǎn)見圖2A。與HNF1A-AS1wt+mimics control組 相 比，HNF1A-AS1 wt+miR-320d組HSC-6 細(xì) 胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與HNF1A-AS1mut+mimics control 組 相比，HNF1A-AS1 mut+miR-320d組HSC-6 細(xì) 胞 熒光 素 酶 活 性 無 變 化（P＞0.05），見 圖2B。 與siRNA NC 組 相 比，HNF1A-AS1siRNA 組 細(xì) 胞內(nèi)miR-320d表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2C。

圖2 HNF1A-AS1 靶向調(diào)控miR-320d 表達(dá)Figure 2 HNF1A-AS1 targeted miR-320d and regulated its expression

2.3 下調(diào)miR-320d 表達(dá)對(duì)HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 的影響

與HOK 細(xì)胞相比，HSC-6 細(xì)胞中miR-320d表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3A。與inhibitor NC 組相比，miR-320dinhibitor 組HSC-6細(xì)胞內(nèi)miR-320d表達(dá)降低，HSC-6 細(xì)胞增殖活力上升，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加，E-cadherin 表達(dá)降低，N-cadherin 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖3B～3G。

圖3 下調(diào)miR-320d 表達(dá)促進(jìn)了HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMTFigure 3 Down-regulation of miR-320d expression promoted the proliferation，invasion and EMT of HSC-6 cells

2.4 上 調(diào)HNF1A-AS1 通 過miR-320d 對(duì)HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 的影響

與mimics NC 相比，miR-320dmimics 組細(xì)胞內(nèi)miR-320d表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4A。與pcDNA-3.1（+）組對(duì)比，pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1組細(xì)胞增殖活力上調(diào)，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加，E-cadherin 表達(dá)下降，N-cadherin 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；與mimics NC+pcDNA-3.1（+）組相比，miR-320dmimics+pcDNA-3.1（+）組細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少，E-cadherin 表達(dá)上升，N-cadherin 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；與pcDNA-HNF1AAS1組相比，pcDNA-3.1（+）-HNF1A-AS1+miR-320dmimics 組HSC-6 細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少，E-cadherin 表達(dá)上升，N-cadherin表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖4B～4F。

圖4 HNF1A-AS1 通過miR-320d 調(diào)控HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMTFigure 4 HNF1A-AS1 regulated HSC-6 cell proliferation，invasion and EMT by miR-320d

2.5 miR-320d 與PBX3 的靶向關(guān)系

miR-320d與PBX3的結(jié)合位點(diǎn)見圖5A。與PBX3wt+mimics control 組相比，PBX3wt+miR-320d組HSC-6 細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與PBX3mut+mimics control 組相比，PBX3mut+miR-320d組HSC-6 細(xì)胞熒光素酶活性無變化（P＞0.05），見圖5B。與inhibitor NC 組相比，miR-320dinhibitor 組PBX3表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5C。

圖5 miR-320d 靶向調(diào)控PBX3 表達(dá)Figure 5 miR-320d targeted PBX3 and regulated its expression

2.6 下調(diào)PBX3 表達(dá)對(duì)HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 的影響

與HOK 細(xì)胞相比，PBX3在HSC-6 細(xì)胞中的表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）見圖6A。與siRNA NC 組相比，PBX3siRNA 組HSC-6細(xì)胞中PBX3表達(dá)降低，HSC-6 細(xì)胞增殖活力下調(diào)，HSC-6 細(xì)胞侵襲數(shù)目減少，N-cadherin 表達(dá)降低，E-cadherin 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖6B～6G。

圖6 下調(diào)PBX3 表達(dá)抑制了HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMTFigure 6 Down-regulation of PBX3 expression promoted the proliferation，invasion and EMT of HSC-6 cells

3 討論

研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）參與了腫瘤的增殖和侵襲和EMT等惡性生物學(xué)表型。例如LncRNA CDKN2BAS通過miR-153-5p促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移［10］；lncRNA SUMO1P3通 過miR-320a促 進(jìn) 乳 腺 癌 進(jìn) 展［11］；lncRNAPTENP1通過AKT 和MAPK 抑制乳腺癌增殖［12］。HNF1A-AS1是從HNF1A基因轉(zhuǎn)錄的相反鏈轉(zhuǎn)錄得到，在人原發(fā)性食管腺癌中首次篩選發(fā)現(xiàn)［13］。研究表明HNF1A-AS1能夠調(diào)節(jié)肺腺癌增殖和轉(zhuǎn)移［14］。在肝癌中，HNF1A-AS1調(diào)控hsa-miR-30b-5p促進(jìn)肝癌發(fā)展［15］。另外，HNF1A-AS1可能是治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)［16］。這些研究表明，HNF1A-AS1可能是一個(gè)促癌分子。本研究發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1在口腔癌細(xì)胞中基因表達(dá)高于正常細(xì)胞，在體外，沉默HNF1A-AS1 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，這些數(shù)據(jù)表明，HNF1A-AS1在口腔癌發(fā)展過程中起致癌基因的作用。

目前的研究表明，口腔癌中微小RNA（microRNA，miRNA）的差異表達(dá)可參與口腔癌的發(fā)展。最近的研究表明，miRNAs 的異常表達(dá)在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。如miR-155-5p靶向ZNF703抑制口腔癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［17］；miR-205靶向IL-24抑制口腔癌細(xì)胞發(fā)展［18］。本研究發(fā)現(xiàn)HNF1AAS1靶向miR-320d促進(jìn)口腔癌的發(fā)展。miR-320d是miR-320家族的重要成員，已有研究報(bào)道m(xù)iR-320家族在大腸腺瘤中下調(diào)；下調(diào)miR-320d促進(jìn)膠質(zhì)瘤 生 長(zhǎng)［19］；miR-320d通 過SOX4抑 制 乳 腺 癌 進(jìn)展［20］。因miR-320d在口腔癌細(xì)胞中的表達(dá)情況是未知的，因此首先檢測(cè)miR-320d在口腔癌和正?？谇患?xì)胞中的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-320d在口腔癌細(xì)胞中低表達(dá)。后續(xù)本實(shí)驗(yàn)使用沉默技術(shù)探討了miR-320d的臨床意義，發(fā)現(xiàn)干擾miR-320d促進(jìn)了HSC-6 細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步揭示了miR-320d在口腔癌發(fā)展中的作用。大量的研究證實(shí)，在胃癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤中miR-144、let7等多種miRNAs 靶向PBX3發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320d和PBX3具有靶向調(diào)控作用。且PBX3在HSC-6 細(xì)胞中高表達(dá)，干擾PBX3會(huì)抑制HSC-6 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，而且HNF1A-AS1能夠通過miR-320d調(diào)控PBX3的表達(dá)。

本研究的結(jié)果顯示，lncRNA HNF1A-AS1在口腔癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過miR-320d/PBX3軸促進(jìn)HSC-6 細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。本研究進(jìn)一步深化了口腔癌進(jìn)展的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了新的策略。