陳紅萍，藍(lán)海軍，鄧 偉，陳會萍，王電文，王記林*，陳大洲*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，江西 南昌 330200；2.江西贛糧實(shí)業(yè)有限公司院士工作站，江西 南昌 330200；3.江西省南昌市再生稻高產(chǎn)栽培工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330200）

【研究意義】當(dāng)前，葉色突變體大多在5～6葉前顯現(xiàn)出不同的葉色表型，白化、黃化、淺綠、條紋、和斑點(diǎn)等，但全生育期表現(xiàn)出淡白葉色突變體還是相對很少。在水稻葉色突變體研究中，一般以白化和黃化突變居多，但由于其通常影響植株光合效率，造成減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡，過去常被認(rèn)為是無意義的突變[1，2]。經(jīng)過多年來對葉色突變體的研究和利用，加上生物技術(shù)的發(fā)展，水稻葉色突變體的研究和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮出越來越重要的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】贛州市農(nóng)科所輻射誘變秈型保持系D57B 干種子，選育出白化（6 葉前）轉(zhuǎn)斑葉型突變體保持系，上海交通大學(xué)輻射誘變粳稻9522（武運(yùn)粳7 號），選擇到中脈白化突變體[3]。江西省超級稻工程技術(shù)研究中心輻射誘變溫敏核不育系廣占63-4S，選育出了一個(gè)白化轉(zhuǎn)綠突變體“白S”[4]。浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所建立了一套利用60C0-Y輻射誘變培育白化轉(zhuǎn)綠突變體的技術(shù)體系，先后育成了帶葉色標(biāo)記的不育系玉兔S、白豐A 等[5-6]。葉色突變是水稻中較常見的一種突變類型，在水稻功能基因組研究、植物光合作用的生理生化機(jī)制研究和遺傳育種應(yīng)用等方面具有無可替代的價(jià)值[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】水稻淡白葉品系是由黃華占自然突變體選育成，全生育期淡白葉型的突變株，而且具有較好的單產(chǎn)水平，經(jīng)江西省2019 年晚稻中熟預(yù)試，667 m2平均產(chǎn)量559.9 kg，表現(xiàn)品質(zhì)3 級優(yōu)質(zhì)米[1]，可能具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】水稻淡白葉品系的選育過程、特征特性、遺傳生理和品質(zhì)等進(jìn)行研究，結(jié)果可為其進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻淡白葉突變體是從黃華占品種（粵農(nóng)科院水稻所周少川研究員育成）生產(chǎn)大田中發(fā)現(xiàn)了1株，自2012年選育至今13代，農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，淡白葉色較穩(wěn)定。通過與野生型黃華占配組，對雜交后代葉色表型進(jìn)行遺傳分析，測定葉綠素含量，解析淡白葉遺傳基礎(chǔ)，并評估其應(yīng)用前景。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 水稻淡白葉突變體的葉色觀察 主要在江西南昌、海南兩地種植，2012年5月20日—2020年5月22日，從播種出苗、移栽、抽穗至成熟，多年觀察其葉色變異規(guī)律。

1.2.2 遺傳變異分析 利用淡白葉突變體與綠葉材料（黃華占、G4-185）構(gòu)建分離群體（F2、BC1F1），調(diào)查分離群體的淡白葉出現(xiàn)的概率，統(tǒng)計(jì)分析其遺傳模型。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀的考察 2018年在廣福村李普根的承包田種植，從5月20日種子干播種，秧齡30 d，6月20 日移栽，栽插密度16.5 cm×23.1 cm，每穴栽4～5 苗，種植面積66.7 m2，田間管理與當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)相同。記載生育階段，即始穗、抽穗、齊穗、灌漿、成熟期，以及性狀穩(wěn)定性和整齊度。在成熟后進(jìn)行5點(diǎn)取樣，考種項(xiàng)目為株高、有效穗、穗長、每穗粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素含量測定 種植于南昌岡上水稻基地，5 月20 日播種，濕潤育秧，在6 月20 日移栽，單本植，栽插密度16.5 cm×23.1 cm，其它田間管理與當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)相同。在田間不同生育時(shí)期即苗期、分蘗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、灌漿期、成熟期，分別選取植株3株，在室內(nèi)取新鮮葉片，將葉片表面擦干凈，去除中脈，剪碎、混勻，稱取5 mg，放入50 mL離心管，加入乙醇-丙酮混合液25 mL，扣緊管蓋，搖勻，黑暗處理24 h，直至葉片呈白色。在處理中可輕輕搖晃試管3～5 次。將葉綠素提取液倒入比色皿中（可反復(fù)2～3次），以混合液為空白對照，分別在波長663，645，470 nm下讀取吸光值并計(jì)算光合色素含量；設(shè)置3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[6]。

1.3.3 指紋鑒定 利用24 對SSR 水稻指紋圖譜標(biāo)記，對水稻淡白葉變態(tài)體與野生型黃華占進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡白葉突變體的發(fā)現(xiàn)

2012年10月8日，在新建珠港農(nóng)場的黃華占生產(chǎn)示范田中發(fā)現(xiàn)淡白葉突變體1株，與黃華占品種正常綠色株比較，葉色淡白，主脈和細(xì)脈綠色，葉脈間顯現(xiàn)淡白色。株高80 cm 左右，穗型較小，粒形相同，千粒質(zhì)量小些，結(jié)實(shí)正常。當(dāng)時(shí)，剛剛進(jìn)入黃熟時(shí)期，主穗頭有一小段淡黃色谷粒，收下了12粒。

2.2 選育過程

將收獲的12 粒種子，當(dāng)年冬繁加代送至海南三亞繁殖（F1），2013 年3 月底田間收種時(shí)，成茵1 株（播種12粒種子成苗1株），葉片淡白色，主脈和細(xì)脈綠色，生長矮小，株高70 cm 左右，有效穗數(shù)4個(gè)，其中分蘗穗較小，結(jié)實(shí)正常，長粒型，收種子215粒（F2）。

2014 年5 月20 日播種，中稻種植于南昌廣福，6 月20 日移栽，單本植，栽插密度16.5 cm×23.1 cm，種植群體145 株，成熟時(shí)按系普法選擇17 個(gè)單株。2014 年冬赴海南三亞藤橋加代繁殖，種植17 個(gè)株系（F3），該世代選擇10 個(gè)單株。2015 年中稻種植于南昌，5 月22 日播種，6 月21 日移栽，種植了10 個(gè)株系（F5），其中有3個(gè)株系變?yōu)榫G色葉（3 個(gè)株系中有1 個(gè)株系在秧苗期表現(xiàn)出淡白葉，栽插后7 d，葉片變成白色，當(dāng)時(shí)記載時(shí)認(rèn)為該株系白色葉不能光合作用會饑餓死亡，但在7 月10 日記載時(shí)全變綠了）。成熟時(shí)選擇11 個(gè)株系，當(dāng)年到海南加代（F6），收回株系5 個(gè)，2015 年5 月在南昌縣廣福種植中稻，成熟后收獲穩(wěn)定株系混收。2016年進(jìn)行品系比較，主要與野生型黃華占進(jìn)行試驗(yàn)比較（圖1）。

圖1 水稻淡白葉品系的選育Fig.1 Breeding light white leaf line in rice

2.3 淡白葉突變體的葉色變化

一般年份淡白葉突變體全生育期均為淡白色，但個(gè)別年份播種后生長第1、2、3、4、5 葉為淡白葉，在6、7、8葉時(shí)期，葉脈白色，淡白葉不明顯，隨后的9、10、11、12、13葉又恢復(fù)明顯的淡白葉表型。

2.4 淡白葉品系農(nóng)藝性狀

淡白葉株系株型適中，分蘗力中上，葉片不披，葉色淡白色，劍葉挺，株高112 cm，莖稈不露節(jié)，較抗倒伏，有效穗9～13 個(gè)，穗長23.3 cm，每穗粒數(shù)179 粒，實(shí)粒數(shù)151.5 粒，結(jié)實(shí)率84.81%，千粒質(zhì)量21.0 g，稃尖無色，粒形長型，落粒性一般，抗病性較好。晚稻播種，6 月20 日，秧齡28～30 d，9 月11 日抽穗，9 月18 日齊穗，播始?xì)v期84 d，全生育期124 d，667 m2平均產(chǎn)量559.9 kg。

2.5 稻米品質(zhì)

來自江西省晚稻預(yù)試參試品種品質(zhì)分析結(jié)果：出糙率79.8%，精米率72.9%，整精米率66.7%，粒長6.8 mm，粒型長寬比3.6，堊白粒率6%，堊白度1.3，直鏈淀粉18.9%，膠稠度50 mm，堿消值6.8 級，透明度1級，水分12.4%。

2.6 遺傳分析

如表1所示，利用淡白葉突變體姐妹系雜交，其F1表型為100%的淡白葉，結(jié)果表明淡白葉突變體已經(jīng)純合，白葉表型可以穩(wěn)定遺傳；利用淡白葉突變體與野生型黃華占進(jìn)行正反交，其F1代均為綠色表型，其F2代出現(xiàn)淡白葉和綠葉兩種類型。同時(shí)，其正反交F1代的回交群體中，黃華占/淡白葉//黃華占的BC1F1世代中全部均為綠色，淡白葉/黃華占//淡白葉的BC1F1世代中出現(xiàn)淡白葉、綠葉兩種類型，以上結(jié)果證實(shí)淡白葉相對綠葉呈隱性遺傳，不存在細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。分離后代中淡白葉占比統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，其F2代淡白葉出現(xiàn)概率為20.83%～23.21%，淡白葉/黃華占//淡白葉的BC1F1世代中淡白葉出現(xiàn)的概率占46.47%，卡方檢測分析表明，淡白葉表型符合單隱性基因遺傳模型。

表1 淡白葉突變體的遺傳分析Tab.1 Genetic analysis of light white leaf mutant

2.7 不同生育期的葉綠素含量及比較分析

測定了淡白葉突變體與野生型黃華占在苗期、分蘗期、拔節(jié)期到孕穗期、抽穗期、灌漿期、乳熟期和黃熟期的葉綠素Cha、Chb、Car、Cht含量。結(jié)果如圖2所示，在淡白葉突變體與黃華占的生長發(fā)育過程中，3種葉綠素含量及葉綠素總量的變化趨勢相對接近。在苗期至孕拔節(jié)期（營養(yǎng)生長時(shí)期），淡白葉突變體的3種葉綠素含量及葉綠素總量大約為黃花占的一半；而在后續(xù)的抽穗至黃熟期（生殖生長時(shí)期）淡白葉突變體的3種葉綠素含量及葉綠素總量與黃花占相當(dāng)。淡白葉突變體前期葉綠素含量的下降使其產(chǎn)生了淡白葉表型，這與淡白葉突變體的表型相符合。生殖生長時(shí)期淡白葉突變體葉綠素含量相對于黃華占沒有明顯差異，為淡白葉突變體的光合作用提供了基礎(chǔ)保障，進(jìn)一步保證了淡白葉突變體的單株產(chǎn)量。

圖2 淡白葉突變體在不同生育期葉綠素含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis of chlorophyll content of light white leaf mutants in different growth stages

2.8 淡白葉突變體與野生型黃華占指紋鑒定

利用24對SSR指紋圖譜標(biāo)記對黃華占，以及兩份黃華占白葉突變體材料1614 和1617 進(jìn)行了基因型檢測。結(jié)果表明：3 份材料之間均差異明顯。其中，1614 與黃華占之間差異位點(diǎn)數(shù)為9個(gè)，差異占比為37.5%；1617與黃華占之間的差異位點(diǎn)數(shù)為5 個(gè)，差異占比為20.8%；整體而言，兩份白葉材料與黃華占均存在較大的差異，認(rèn)定為不同的品種（系）。淡白葉材料1617 與黃華占的血緣更接近（圖3）。

圖3 淡白葉株系與黃華占指紋鑒定分析Fig.3 Comparative analysis of fingerprint identification between light white leave lines and Huang Hua Zhan

3 結(jié)論與討論

3.1 淡白葉突變體的特征

在葉色表型上，與野生型黃華占品種是相比，淡白葉株的全生育期是淡白色表型，遠(yuǎn)看為白色，近看淡白色。從葉綠素含量比較，野生型黃華占品種的苗期、分蘗期和拔節(jié)期的葉綠色逐步上升（5.1～7.69），到了孕穗期下降較大（4.72），抽穗期略有上升（5.77），灌漿至成熟是逐步下降（3.93～2.07），而且下降度大；淡白葉株的葉綠素含量苗期至孕穗逐步上升（3.04～3.80），直到抽穗最高（5.23），灌漿至成熟是逐步下降（4.91～2.29）與野生型黃華占品種相同趨勢。淡白葉突變體在晚稻區(qū)試667 m2平均產(chǎn)量達(dá)到559.9 kg，說明營養(yǎng)生長時(shí)期淡白葉突變體葉綠素含量的降低對其產(chǎn)量影響不大，同時(shí)生殖生長時(shí)期淡白葉突變體葉綠素含量的穩(wěn)定使其產(chǎn)量有了一定的保證，這表明該淡白葉突變體具有潛在的利用價(jià)值。

3.2 淡白葉突變體的“返綠現(xiàn)象”

自然淡白葉突變株，經(jīng)過多代系譜選擇，育成淡白葉突變體在一般情況下全生育期表現(xiàn)出淡白葉，但個(gè)別年份會出現(xiàn)1、2、3、4、5、6、7 葉淡白葉，8、9、10 葉表現(xiàn)綠色，但葉色比野生型黃華占要淡，第11、12、13葉表現(xiàn)為淡白葉。選育過程中發(fā)現(xiàn)，1株淡白葉突變體于5月22日播種，苗期葉片呈現(xiàn)為典型的淡白葉，在移栽后（7月3日）葉片顏色變得比苗期更白，呈純白色。7月15日后，該白葉突變體葉色轉(zhuǎn)綠，且整個(gè)生育期葉色均保持為綠色。

盡管經(jīng)典遺傳分析表明淡白葉表型為單隱性基因調(diào)控，自然突變株經(jīng)過多代的選擇、穩(wěn)定、多季、異地（海南）種植，遇適宜轉(zhuǎn)綠溫度時(shí)，可從淡白葉轉(zhuǎn)為綠色。已有研究[8-10]表明，水稻白化突變體轉(zhuǎn)綠與溫度關(guān)聯(lián)度很高，可分為“高溫敏感型”“低溫敏感型”“溫頓型”。因此，筆者推斷該淡白葉突變體的“淡綠現(xiàn)象”應(yīng)該與溫度的變化相關(guān)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步分析。

3.3 淡白葉突變系的育種利用

在彩色稻中，利用淡白葉突變系作親本，與紫色稻、黃色稻、綠色稻進(jìn)行雜交，其后代可以選育出不同的淡色、更淡色，或更濃色彩，利用彩色稻更好地構(gòu)建彩色圖案。同時(shí)，可以將該淡白葉突變體應(yīng)用于水稻育種中，能選育出目標(biāo)新父本、母本系，形成雜交水稻新品種。

致謝：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動基金項(xiàng)目（2019CBS002）同時(shí)對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！