顧海聞，農(nóng)源，蔣薇，2，王冬英，梁萬(wàn)文，陳漢忠，吳文德*

（1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2賀州市水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西賀州 542899；3廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021）

0 引言

【研究意義】羅非魚(yú)是引入我國(guó)養(yǎng)殖最廣泛的魚(yú)類，具有雜食性、生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)（林虹等，2013）。近年來(lái)，我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口量均居世界首位，羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)已成為我國(guó)漁業(yè)的主要組成部分（Yuan et al.，2017；敖秋桅和朱佳杰，2020）。廣西是我國(guó)羅非魚(yú)的養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)之一，但在廣西各養(yǎng)殖區(qū)域羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病常呈暴發(fā)性流行，養(yǎng)殖戶為了控制疫情通常濫用各種藥物，致使病原菌普遍產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重威脅廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（呂小麗等，2017）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年廣西地區(qū)因無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）感染引起的羅非魚(yú)死亡量超過(guò)7000 t，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)8610.8萬(wàn)元；2012年羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌感染給我國(guó)漁業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)12億元（張行等，2020）。無(wú)乳鏈球菌是一種條件性致病菌，當(dāng)羅非魚(yú)皮膚和腸黏膜受損時(shí)，病原菌更易侵入魚(yú)體加重感染及增加死亡率。因此，探索無(wú)乳鏈球菌感染方式對(duì)羅非魚(yú)血常規(guī)的影響及特異性抗體產(chǎn)生的消長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)開(kāi)展羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)疫情預(yù)警和制定無(wú)乳鏈球菌抗體判斷標(biāo)準(zhǔn)均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】表皮是魚(yú)類與水生環(huán)境間的生物屏障，可保護(hù)魚(yú)類免受傳染病感染（Ellis，2001），而皮膚損傷直接影響魚(yú)類對(duì)細(xì)菌或病毒的易感性（Noble et al.，2012）。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)魚(yú)類皮膚屏障受損原因及其與細(xì)菌感染間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行大量研究。Greaves和Tuene（2001）研究提出魚(yú)眼球受到創(chuàng)傷會(huì)引起嚴(yán)重的細(xì)菌繼發(fā)感染；Barthel等（2003）使用有繩結(jié)的網(wǎng)進(jìn)行養(yǎng)殖魚(yú)群轉(zhuǎn)池時(shí)會(huì)造成魚(yú)鰭表皮受損，進(jìn)而增加魚(yú)類疾病的感染率及死亡率；Braithwaite和McEvoy（2004）發(fā)現(xiàn)魚(yú)類在游泳時(shí)擦掉鱗片將極大增加患細(xì)菌或病毒病的風(fēng)險(xiǎn)；Harmache等（2006）研究發(fā)現(xiàn)傳染性造血壞死病毒會(huì)通過(guò)魚(yú)鰭損傷部位侵入體內(nèi)而造成感染；D’Orbcastel等（2009）研究表明，飼養(yǎng)密度過(guò)高及抽水時(shí)水流速度太快均會(huì)增加魚(yú)體碰撞造成體表受損的概率；L?voll等（2009）發(fā)現(xiàn)體表受損的大西洋鮭魚(yú)更易感染Moritella viscosa；Jin等（2009）研究表明，寄生蟲(chóng)侵染橄欖比目魚(yú)表皮后通常引起皮膚炎癥和損傷，繼發(fā)細(xì)菌感染，導(dǎo)致單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞水平明顯降低；Rombout等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病原體從硬骨魚(yú)肛門(mén)進(jìn)入受損腸道內(nèi)時(shí)，僅需少量抗原量就能引發(fā)全身抗體水平顯著升高；Koppang等（2015）認(rèn)為魚(yú)鰓表面黏膜受損將增大病原體侵入的概率，并引起魚(yú)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】無(wú)乳鏈球菌可通過(guò)糞口傳播感染周圍魚(yú)群，同時(shí)腹腔注射、肌肉注射、鰓接種、鼻腔接種、浸泡、灌胃含菌飼料等方法均能致使羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌而發(fā)?。▌⑾?，2015；羅偉等，2018；敖秋桅和朱佳杰，2020）。此外，有學(xué)者開(kāi)展了高鹽堿度、低溶解氧和高水溫等環(huán)境因素與無(wú)乳鏈球菌易感性間的關(guān)聯(lián)研究（祝璟琳和楊弘，2013），但鮮見(jiàn)針對(duì)無(wú)乳鏈球菌感染與羅非魚(yú)創(chuàng)傷或炎癥關(guān)聯(lián)的報(bào)道，因此妨礙了新型有效藥物及候選疫苗分子的發(fā)現(xiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)建立羅非魚(yú)皮膚創(chuàng)傷模型和腸炎模型，模擬自然環(huán)境下羅非魚(yú)體表?yè)p傷和細(xì)菌性腸炎，以健康羅非魚(yú)為對(duì)照，對(duì)不同健康狀況的羅非魚(yú)進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌浸泡感染，觀測(cè)急性感染無(wú)乳鏈球菌后的魚(yú)體健康狀況，檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)量和種類變化及免疫應(yīng)答血清抗體IgM的消長(zhǎng)規(guī)律，旨在明確表皮損傷或某種原因造成的炎癥是否是羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病暴發(fā)的重要誘因，為羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)疫情預(yù)警及無(wú)乳鏈球菌疫苗研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

吉富羅非魚(yú)（平均體質(zhì)量約40 g）購(gòu)自廣西南寧羅非魚(yú)良種場(chǎng)，暫養(yǎng)于消毒過(guò)的魚(yú)池（長(zhǎng)7.0 m×寬1.5 m×高1.2 m）內(nèi)，每天飼喂人工配合飼料，水溫保持在20~25℃，全天24 h供氧。無(wú)乳鏈球菌HN株和羅非魚(yú)陰、陽(yáng)性血清及HRP標(biāo)記鼠抗羅非魚(yú)IgM單克隆抗體由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存提供。間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽、紅細(xì)胞裂解液和四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；脫脂奶粉、0.01 mol/L PBS（pH 7.2~7.4）粉末、大豆蛋白胨、胰蛋白胨及氯化鈉購(gòu)自北京北京索萊寶科技有限公司；三硝基苯磺酸（TNBS）購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)乳鏈球菌培養(yǎng).對(duì)無(wú)乳鏈球菌HN株進(jìn)行復(fù)蘇，在含5%兔血的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上劃線培養(yǎng)，挑取單個(gè)典型菌落接種至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)菌液6000 r/min離心5 min，棄上清液，細(xì)菌沉淀加入滅菌生理鹽水，用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整濃度至1.5×106CFU/mL。

1.2.2 試驗(yàn)分組與處理.將180尾健康羅非魚(yú)隨機(jī)分為3組（健康組、皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組），每組60尾。皮膚創(chuàng)傷組處理：用無(wú)菌打孔器在靠近羅非魚(yú)背鰭部打2個(gè)孔（孔徑1.5 mm，孔深1.0 mm），放入32℃的50 L水族箱飼養(yǎng)。腸炎組處理：參考宋學(xué)宏（2015）的方法，羅非魚(yú)禁食24 h后放入60 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽溶液中浸泡麻醉10 min，采用聚丙烯管插入羅非魚(yú)肛門(mén)上端1 cm處，灌入0.06 mL的2.5%三硝基苯磺酸乙醇溶液，放入32℃水族箱飼養(yǎng)。飼養(yǎng)2 d待羅非魚(yú)生命狀態(tài)穩(wěn)定后向水族箱（長(zhǎng)60 cm×寬45 cm×高55 cm）投入10 mL的1.5×106CFU/mL無(wú)乳鏈球菌懸液感染羅非魚(yú)。同時(shí)設(shè)3組空白對(duì)照組，不感染無(wú)乳鏈球菌，每組60尾。恒溫加熱棒控制水溫維持在32℃，全天24 h供氧，定時(shí)觀察羅非魚(yú)的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d。所有羅非魚(yú)均參考廣西大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理審查（GXU2020-010）進(jìn)行處理。

1.2.3 白細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定.分別于無(wú)乳鏈球菌感染前及感染后24、48、72、96、120、144和168 h等8個(gè)時(shí)段，從健康組、皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組中隨機(jī)選取15尾羅非魚(yú)，進(jìn)行魚(yú)尾鰭靜脈采血，采集的血液樣品經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后采用白細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Bio-Rad全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)外周血白細(xì)胞總數(shù)，同時(shí)經(jīng)吉姆薩染色后觀察并統(tǒng)計(jì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量。統(tǒng)計(jì)感染無(wú)乳鏈球菌7 d內(nèi)各處理組羅非魚(yú)的死亡尾數(shù)。

1.2.4 抗體測(cè)定.抗體測(cè)定參照吳文德等（2020）的方法：將1.5×108CFU/mL的菌懸液加入酶標(biāo)板孔中，50 μL/孔，56℃烘箱烘干；加入-20℃預(yù)冷的甲醇，100 μL/孔，室溫固定15 min，棄甲醇，用蒸餾水洗滌3次，5 min/次；每孔加入200 μL 5%脫脂奶粉，放入恒溫箱37℃封閉2 h，PBS洗滌3次，5 min/次；將待檢血清進(jìn)行1∶4稀釋，每孔加入100 μL，放入恒溫箱中37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌3次，5 min/次；每孔加入100 μL以PBS按1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記鼠抗羅非魚(yú)IgM單克隆抗體，放入恒溫箱中37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌3次，5 min/次；每孔加入100 μL TMB-H2O2顯色液，放入恒溫箱中37℃避光顯色20 min；每孔加入50 μL的2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀上讀取OD450值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2018和Graph Pad v9.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。其中，多時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)選用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），組間差異則采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚(yú)幾種白細(xì)胞的形態(tài)特征

經(jīng)姬姆薩染色后在1000×顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞的細(xì)胞核很大，染色較深，呈紫紅色，且偏向于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)染色較淺；淋巴細(xì)胞一般呈圓形，細(xì)胞核圓形，所占比例大，質(zhì)地緊密，細(xì)胞質(zhì)所占比例很小，僅在細(xì)胞核外圍形成細(xì)窄環(huán)狀，細(xì)胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核深染呈紫紅色；嗜中性粒細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核大、致密，偏向細(xì)胞一側(cè)，且通常分成兩葉，呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)則呈淡紫色。

圖1 羅非魚(yú)幾種白細(xì)胞的形態(tài)特征（姬姆薩染色）Fig.1 Morphology of white blood cells of tilapia（WBCs）

2.2 不同處理組羅非魚(yú)的感染死亡情況

由圖2可知，與健康組羅非魚(yú)相比，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)的死亡時(shí)間提前，健康組羅非魚(yú)至感染后第7 d的累計(jì)死亡率為33.3%，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組則分別為53.3%和46.7%，均呈顯著升高趨勢(shì)（P＜0.05，下同），說(shuō)明宿主的機(jī)體損傷會(huì)促進(jìn)感染加重及病程延長(zhǎng)。

圖2 不同處理組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后7 d內(nèi)的存活率比較Fig.2 Comparison of survival rates of tilapia in different groups within 7 d after artificial infection with S.agalactiae

2.3 不同處理組羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)

試驗(yàn)期間，各感染組羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞數(shù)量均呈先增加后減少的變化趨勢(shì)（圖3）。皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)分別在感染無(wú)乳鏈球菌后72和24 h上升至峰值，且極顯著高于健康組羅非魚(yú)（P＜0.01，下同）。除感染后24和144 h外，皮膚創(chuàng)傷組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后的外周血白細(xì)胞總數(shù)量均顯著或極顯著高于健康組羅非魚(yú)；腸炎組羅非魚(yú)從感染無(wú)乳鏈球菌起直至感染后48 h，其外周血白細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于健康組羅非魚(yú)，至感染后72 h下降至與健康組羅非魚(yú)無(wú)顯著差異（P＞0.05，下同）。至感染后168 h，由于健康組羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步下降，低于初始值，導(dǎo)致皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞數(shù)量又極顯著高于健康組羅非魚(yú)?？梢?jiàn)，無(wú)乳鏈球菌感染皮膚創(chuàng)傷或患有腸炎的羅非魚(yú)相對(duì)于健康魚(yú)能引起更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

圖3 不同處理組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后外周血白細(xì)胞數(shù)量的變化情況Fig.3 Changes in the number of peripheral blood leukocytes of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.4 不同處理組羅非魚(yú)外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)

皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)經(jīng)浸泡感染無(wú)乳鏈球菌后，其外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量迅速增殖，從感染后24 h即與健康組羅非魚(yú)存在極顯著差異（圖4）。皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)的外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量分別在感染后96和24 h后達(dá)峰值，皮膚創(chuàng)傷組羅非魚(yú)在感染后168 h內(nèi)持續(xù)極顯著高于健康組羅非魚(yú)，腸炎組羅非魚(yú)則在感染后24~48 h內(nèi)極顯著高于健康組羅非魚(yú)，之后逐漸下降至正常水平，至感染后168 h再次極顯著高于健康組羅非魚(yú)。

圖4 不同處理組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量的變化情況Fig.4 Changes in the number of neutrophils in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.5 不同處理組羅非魚(yú)外周血單核細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)

由圖5可看出，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)經(jīng)浸泡方式感染無(wú)乳鏈球菌120和24 h后，其外周血單核細(xì)胞數(shù)分別上升至峰值。皮膚創(chuàng)傷組羅非魚(yú)在感染后72~168 h的外周血單核細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于健康組羅非魚(yú)，而腸炎組羅非魚(yú)只在感染后24 h極顯著高于健康組羅非魚(yú)，之后降至正常水平。

圖5 不同處理組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后外周血單核細(xì)胞數(shù)量的變化情況Fig.5 Changes in the number of monocytes in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.6 不同處理組羅非魚(yú)外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)

皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)在感染無(wú)乳鏈球菌后72和24 h，其外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量分別達(dá)峰值。皮膚創(chuàng)傷組羅非魚(yú)從感染后24~168 h的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于健康組羅非魚(yú)；腸炎組羅非魚(yú)在感染后24~48 h的淋巴細(xì)胞數(shù)量極顯著高于健康組羅非魚(yú)，感染后72~96 h則顯著或極顯著低于健康組羅非魚(yú)，但感染后144~168 h腸炎組羅非魚(yú)的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量再次極顯著高于健康組羅非魚(yú)（圖6）。

圖6 不同處理組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化情況Fig.6 Changes in the number of lymphocytes in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.7 不同處理組羅非魚(yú)血清IgM抗體水平的變化趨勢(shì)

由圖7可看出，皮膚創(chuàng)傷組和健康組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后產(chǎn)生特異性IgM抗體的時(shí)間較接近，均在第3周后大幅升高；相對(duì)于健康組羅非魚(yú)，皮膚創(chuàng)傷組羅非魚(yú)的特異性抗體維持時(shí)間更久，7周后才降至正常水平，健康組羅非魚(yú)則在6周時(shí)已降至正常水平。與皮膚創(chuàng)傷組和健康組羅非魚(yú)相比，腸炎組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后產(chǎn)生特異性抗體的時(shí)間更早，1周后即開(kāi)始大幅升高，持續(xù)6周后才降至正常水平。

圖7 不同處理組羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后血清IgM抗體水平的變化情況Fig.7 Changes in the IgM antibody level in serum of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

3 討論

與哺乳動(dòng)物相似，魚(yú)類的免疫系統(tǒng)分為特異性免疫和非特異性免疫。外周血白細(xì)胞數(shù)量的變化直接影響魚(yú)體特異性免疫和非特異性免疫的應(yīng)答功能（Kaattari and Piganelli，1996；Manning and Nakanishi，1996；Secombes，1996）。魚(yú)類受細(xì)菌、病毒及有毒物質(zhì)侵染時(shí)，其白細(xì)胞數(shù)量發(fā)生顯著變化，如遭受嗜水氣單胞菌感染的日本鰻鱺（張偉妮等，2011）及患敗血癥的鰱魚(yú)（米瑞芙等，1993），其白細(xì)胞數(shù)量顯著增多；攝入殺蟲(chóng)劑的鯉魚(yú)（王媛等，2005），其白細(xì)胞數(shù)量隨殺蟲(chóng)劑濃度的升高而增加。白細(xì)胞借助變形特性穿透血管壁，行使趨化功能，移動(dòng)至細(xì)菌、毒素、機(jī)體細(xì)胞降解物等有害物質(zhì)處，包圍并利用胞內(nèi)各種酶系分解或消化吞噬有害物質(zhì)。本研究也證實(shí)，羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞數(shù)量的變化與機(jī)體損傷、炎癥及免疫反應(yīng)相關(guān)，即白細(xì)胞數(shù)量變化可作為判斷羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后病理?yè)p傷和免疫應(yīng)答的一個(gè)參考指標(biāo)。白細(xì)胞按有無(wú)胞內(nèi)顆粒物可分為有顆粒白細(xì)胞和無(wú)顆粒白細(xì)胞兩大類，前者主要是中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，后者包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。中性粒細(xì)胞在感染初期發(fā)揮抵御病原菌入侵的作用，淋巴細(xì)胞則主要參與特異性免疫應(yīng)答。李利和張其中（2007）以車輪蟲(chóng)感染羅非魚(yú)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在感染初期呈顯著上升趨勢(shì)；但Pasnik等（2005）研究表明注射疫苗的羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后47 d其抗體水平才開(kāi)始顯著上升，于感染后90 d達(dá)峰值。本研究中，羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后的抗體水平上升時(shí)間較Pasnik等（2005）的研究結(jié)果提前，可能與本研究的無(wú)乳鏈球菌感染濃度較高有關(guān)。

羅非魚(yú)機(jī)體出現(xiàn)損傷或炎癥時(shí)，其外周血白細(xì)胞數(shù)量顯著增加，主要是由于中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增多而引起，與Ranzani-Paiva等（2004）以分歧桿菌腹腔感染尼羅羅非魚(yú)后的白細(xì)胞數(shù)量變化趨勢(shì)相似。皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)的無(wú)乳鏈球菌感染死亡率明顯高于健康組羅非魚(yú)，而感染空白對(duì)照組無(wú)羅非魚(yú)死亡現(xiàn)象，說(shuō)明羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后會(huì)加重因轉(zhuǎn)池、運(yùn)輸、寄生蟲(chóng)感染等造成魚(yú)體表皮受到的損傷，或飼料霉變等原因造成的腸炎，從而促使羅非魚(yú)死亡。在3種感染方式中，羅非魚(yú)的中性粒細(xì)胞數(shù)量與未感染無(wú)乳鏈球菌時(shí)相比均明顯增加，因此可作為羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌的重要判定指標(biāo)之一。魚(yú)類白細(xì)胞中的單核細(xì)胞具有活躍的變形運(yùn)動(dòng)和吞噬能力，能吞噬并分解侵入機(jī)體的細(xì)菌，是結(jié)締組織巨噬細(xì)胞的前身，在一定條件下可分化為巨噬細(xì)胞等而參與免疫反應(yīng)，同時(shí)作為天然免疫和獲得性免疫間的重要環(huán)節(jié)，可將抗原產(chǎn)物傳遞給淋巴細(xì)胞，協(xié)助淋巴細(xì)胞在免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用（袁仕取等，1998）。此外，皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)的外周血單核細(xì)胞數(shù)量顯著高于空白組羅非魚(yú)，說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌感染會(huì)加重羅非魚(yú)自身表皮受損或某些原因產(chǎn)生的炎癥，無(wú)乳鏈球菌在自然條件中廣泛存在，是條件性致病菌，因此可將單核細(xì)胞數(shù)量變化作為監(jiān)測(cè)羅非魚(yú)是否受感染無(wú)乳鏈球菌的參考指標(biāo)。淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓多能造血干細(xì)胞，可劃分為T(mén)淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、K細(xì)胞和NK細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞受抗原物質(zhì)刺激后能分化增殖產(chǎn)生免疫活性細(xì)胞，在免疫應(yīng)答過(guò)程中起核心作用（Vallejo et al.，1992）。本研究中，健康組羅非魚(yú)在感染無(wú)乳鏈球菌后期其淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著升高，而皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)均在感染后期出現(xiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)量下降現(xiàn)象，說(shuō)明機(jī)體損傷和炎癥對(duì)羅非魚(yú)免疫反應(yīng)有抑制作用，與Verburg-van Kemenade等（1999）、Engelsma等（2003）的研究結(jié)果一致，即遭受應(yīng)激的魚(yú)體血液皮質(zhì)醇濃度增加引起淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、嗜中粒細(xì)胞數(shù)量增加的表現(xiàn)一致，說(shuō)明其作用機(jī)制存在一定關(guān)聯(lián)性。

在細(xì)菌入侵時(shí)，魚(yú)體也會(huì)與哺乳動(dòng)物一樣產(chǎn)生針對(duì)病原菌的特異性抗體。IgM是魚(yú)類特異性免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì)之一，其血清抗體效價(jià)可直接反映魚(yú)體免疫接種的效果及病原菌感染后對(duì)魚(yú)體造成的影響（陳昌福，1998）。本研究中，不同健康狀況下以無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚(yú)均會(huì)產(chǎn)生明顯的特異性抗體，且達(dá)峰值后高抗體水平能維持一段時(shí)間。但不同機(jī)體條件下羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能力有區(qū)別，特異性抗體產(chǎn)生的時(shí)間也存在時(shí)效差異，健康組羅非魚(yú)在遭受無(wú)乳鏈球菌侵襲時(shí)，其皮膚的固有屏障作用致使大部分抗原顆粒停留在皮膚和魚(yú)鰓中，僅有相對(duì)少量的抗原進(jìn)入機(jī)體，免疫應(yīng)答也主要發(fā)生在黏膜免疫組織，因此血清抗體出現(xiàn)較皮膚創(chuàng)傷組和腸炎組羅非魚(yú)晚，且血清抗體水平維持時(shí)間較短，消退較快。皮膚創(chuàng)傷模型制的人工造創(chuàng)口較小，皮膚的完整性和皮膚黏膜免疫并無(wú)明顯下降趨勢(shì)，在感染無(wú)乳鏈球菌后其血清抗體產(chǎn)生的時(shí)間與健康組羅非魚(yú)相近，但相對(duì)于健康魚(yú)體，浸泡感染過(guò)程中無(wú)乳鏈球菌更易從創(chuàng)口進(jìn)入機(jī)體，且在后續(xù)的感染過(guò)程中無(wú)乳鏈球菌持續(xù)作用，血清抗體達(dá)峰值后較健康組羅非魚(yú)持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。在腸炎組羅非魚(yú)中，魚(yú)體抵抗環(huán)境病原體侵襲的最初屏障受損，腸黏膜系統(tǒng)對(duì)魚(yú)類免疫保護(hù)機(jī)能下降，黏膜免疫系統(tǒng)此時(shí)無(wú)法獨(dú)立于系統(tǒng)免疫完成免疫應(yīng)答，大量無(wú)乳鏈球菌進(jìn)入機(jī)體，血清抗體出現(xiàn)時(shí)間早且達(dá)峰值時(shí)間長(zhǎng)?？梢?jiàn)，提高有效抗體水平的維持時(shí)間是確保羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌疫苗免疫成功的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

羅非魚(yú)在無(wú)乳鏈球菌感染前后并發(fā)機(jī)械性或免疫性病理?yè)p傷及炎癥，會(huì)導(dǎo)致感染死亡率升高，即感染無(wú)乳鏈球菌后會(huì)加重因轉(zhuǎn)池、運(yùn)輸、寄生蟲(chóng)感染等造成魚(yú)體表皮受損，或飼料霉變等原因造成的腸炎，進(jìn)而導(dǎo)致羅非魚(yú)死亡率上升。血常規(guī)和抗體水平的消長(zhǎng)規(guī)律能反映羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的感染情況，其中，外周血白細(xì)胞數(shù)量變化可作為判斷羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后病理?yè)p傷和免疫應(yīng)答的參考指標(biāo)。