蔡錦玲 姚文 陳品品 藍(lán)波妙 林濤

（泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建泉州 362200）

野生番茄經(jīng)過幾百年的馴化已成為受世人喜愛的經(jīng)濟(jì)蔬菜之一[1]。番茄果實(shí)顏色是重要的外觀品質(zhì)性狀之一，果實(shí)越紅其營養(yǎng)品質(zhì)越好，在鮮食或加工方面更受市場的歡迎[2]。果實(shí)顏色由果皮和果肉顏色共同作用，其中果肉顏色受多基因控制，而果皮顏色的分子遺傳機(jī)制相對(duì)簡單，但目前針對(duì)番茄果皮顏色開發(fā)分子標(biāo)記和精準(zhǔn)測量及分類方法的報(bào)道仍然較少，不利于果皮顏色分子選擇育種工作的開展。開發(fā)新的基因功能標(biāo)記并使用色差儀快速精準(zhǔn)地測量果皮顏色，為番茄果皮顏色的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供技術(shù)支持，對(duì)加快番茄果實(shí)色澤的選育進(jìn)程具有重要意義。

番茄果實(shí)顏色豐富，有紅色、粉色、黃色、綠色、紫色和橙色等[3]。果肉顏色受多個(gè)基因的控制，在類胡蘿卜素和花青素代謝途徑中，因r、nor、Gr、Cnr、Nr、hp、t、Del、Aft、atv、Abg等的突變或滲入使得番茄果實(shí)呈現(xiàn)出多種顏色[4-6]。番茄果皮顏色相對(duì)簡單和易于分組，一般可分為有色和無色透明果皮2種，有色果皮對(duì)無色果皮呈顯性作用，受基因SIMYB12控制[7-8]，在果實(shí)發(fā)育過程中，因SIMYB12基因無法表達(dá)而不能在果皮中積累類黃酮，從而使成熟果實(shí)的果皮為無色透明，但果皮無色透明的番茄風(fēng)味和口感更好。當(dāng)SIMYB12基因正常表達(dá)時(shí)，成熟果實(shí)的果皮表現(xiàn)為有色，更耐儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。

果皮顏色的鑒定主要有直觀鑒定法或儀器測定法。直觀鑒定法，是經(jīng)典且使用方便、基礎(chǔ)簡單的測色方法，僅適用易于分類顏色的分級(jí)工作，但植物種皮顏色變異范圍極為廣泛，多呈連續(xù)性分布，直觀鑒定法易受人為因素的影響，容易忽略一些中間的過渡色[9]，不利于顏色的精確測量、分類和量化分析，儀器測定法是指通過運(yùn)用儀器（通常是色差儀）將顏色轉(zhuǎn)為精準(zhǔn)的數(shù)值，使顏色數(shù)值化、具體化和可視化，操作簡單、耗時(shí)短，能夠?qū)︻伾珜?shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的測量和分類[10]。目前色差儀在許多作物的果皮顏色或者果色測量上均有應(yīng)用，如在櫻桃番茄[11]、黃瓜[12]和辣椒[13-14]等的應(yīng)用。

由于生活品質(zhì)的提高，市場上對(duì)無色透明果皮紅色果肉的粉果番茄需求不斷增加，而目前應(yīng)用于番茄果皮顏色的功能標(biāo)記及精準(zhǔn)測量的研究相對(duì)較少。祝光濤[15]研究發(fā)現(xiàn)，在粉果番茄SIMYB12基因起始密碼子上游4 kbp處存在大小為603 bp的序列缺失，會(huì)影響基因的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)果皮顏色造成一定的影響。因此，本研究就該位點(diǎn)設(shè)計(jì)與番茄果皮顏色相對(duì)應(yīng)的分子功能標(biāo)記，并利用30份不同類型的番茄種質(zhì)資源進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)色差儀的Lab和Ch測量值與果皮顏色相關(guān)性進(jìn)行分析，快速準(zhǔn)確地區(qū)分不同果色番茄的果皮顏色，探索不同果皮顏色的分類閾值。雖然SIMYB12基因不同單倍型對(duì)果皮顏色的影響已有報(bào)道[15-16]，但通過設(shè)計(jì)分子功能標(biāo)記對(duì)不同的大果番茄和櫻桃番茄種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和利用尚未見報(bào)道。本研究基于SIMYB12基因上對(duì)果皮顏色有影響的缺失位點(diǎn)，開發(fā)可用于瓊脂糖電泳并且重復(fù)性好的分子功能標(biāo)記，并利用色差儀實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的果皮顏色分類，為番茄果皮顏色的分子輔助選擇育種和表型鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 選擇泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所收集的30份番茄種質(zhì)資源為供試材料，包括櫻桃番茄28份（其中黃色櫻桃番茄3份、紫色櫻桃番茄2份、紅色櫻桃番茄23份）和紅色大果番茄2份，命名從編號(hào)P1～P30，果型和果實(shí)顏色如圖1所示。

圖1 三十份番茄種質(zhì)資源的果型和顏色

1.1.2 試劑和儀器 分子實(shí)驗(yàn)試劑耗材均購自北京索萊寶科技有限公司；分子功能標(biāo)記引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；INFINITE 200 PRO酶標(biāo)儀為Tecan公司生產(chǎn)；水平電泳儀、Universal Hood PCR儀、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)為BIO-RAD公司生產(chǎn)；色差儀為漢潽公司生產(chǎn)的HP-C220精密色差儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度測試 參照Saghai- Maroof等[17]方法，采用CTAB法提取番茄幼葉基因組總DNA。DNA的濃度使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測試。根據(jù)測定結(jié)果，添加TE使得各試驗(yàn)材料的DNA濃度在50～100 ng/μL。

1.2.2 果皮顏色SIMYB12基因分子功能標(biāo)記設(shè)計(jì) 祝光濤[15]基于番茄參考基因組SL2.40版本的研究結(jié)果顯示，番茄果皮顏色基因SIMYB12在1號(hào)染色體的SL2.40ch01: 70 935 936-70 938 394 bp上，在其上游4 kbp的位置上存在著603 bp的缺失。目前番茄參考基因組已更新到SL4.0版本，依據(jù)SIMYB12基因的最新注釋信息，從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站下載番茄的最新組裝基因組，通過序列比對(duì)確定該基因和缺失片段的位置，并提取基因及其上下游10 kbp的序列區(qū)域（SL4.0ch01: 71 312 725-71 326 073 bp），用Oligo 7軟件（http://www.oligo.net/downloads.html）于缺失603 bp的兩側(cè)適當(dāng)位置進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小滿足于在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測；接著將設(shè)計(jì)完成的引物在NCBI上與番茄的全基因組進(jìn)行Primer-Blast比對(duì)，確定引物的特異性，篩選合格的引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測 PCR反應(yīng)體系（15 μL）：模板DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL,dNTPs 0.6 μL，前后引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O 10.4 μL。反應(yīng)在艾本德Universal Hood PCR儀上進(jìn)行。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58.6℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。為了確定不同引物最適合的退火溫度，不同引物PCR退火溫度均依據(jù)梯度結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，梯度溫度范圍為43～59℃。

瓊脂糖凝膠電泳：DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠添加1%的gel red核酸染料進(jìn)行電泳，置于伯樂GelDoc凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。統(tǒng)計(jì)各樣本的擴(kuò)增條帶，大片段帶型記為1，小片段帶型記為3，雜合帶型記為2，缺失數(shù)據(jù)記為0。

1.2.4 果皮顏色色差儀測量 隨機(jī)選擇充分成熟番茄果實(shí)，沿果面赤道一周均勻取3個(gè)點(diǎn)，用色差儀測得L、a、b、C和h的數(shù)值后取平均值。每份材料測定3個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)重復(fù)測定3次。色差儀的5個(gè)測量值具有不同的涵義：L代表黑白通道，0表示黑色，100表示白色。a代表紅綠通道，a>0表示顏色偏紅，a<0表示顏色偏綠。b代表黃藍(lán)通道，b>0表示顏色偏黃，b<0表示顏色偏藍(lán)。C值反映色彩飽和度或純粹度，色度越大，顏色越鮮艷；h值為色調(diào)角，反映紅綠藍(lán)3個(gè)基本色及其之間的過渡顏色，0°表示純紅色，120°表示純綠色，240°表示純藍(lán)色。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)的整理、分析和圖形繪制采用開源工具R（4.0.2，https://www.r-project.org/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樣品DNA質(zhì)量檢測

使用酶標(biāo)儀對(duì)提取的番茄種質(zhì)DNA進(jìn)行快速檢測，結(jié)果（表1）表明，樣品濃度OD260nm/OD280nm范圍在1.81～1.99，比值小于1.9的樣品10份，比值大于1.9的樣品20份，平均值為1.92，可見供試的30份番茄種質(zhì)DNA提取質(zhì)量均滿足后續(xù)常規(guī)PCR擴(kuò)增。

表1 三十份供試番茄種質(zhì)資源DNA的質(zhì)量

2.2 功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

從NCBI網(wǎng)站下載最新的番茄基因組DNA序列，通過序列比對(duì)定位缺失的603 bp位置(圖2)。利用Oligo 7設(shè)計(jì)引物，基于基因SIMYB12上游缺失序列的區(qū)域設(shè)計(jì)的產(chǎn)物擴(kuò)增片段大小在200～2 000 bp，該標(biāo)記適合在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，并且經(jīng)Oligo 7軟件檢驗(yàn)可知，其無發(fā)夾、引物二聚體等次級(jí)結(jié)構(gòu)，所以設(shè)計(jì)的引物理論可行。

圖2 缺失位置及A-10功能標(biāo)記的序列信息

本研究基于SIMYB12基因共設(shè)計(jì)了16對(duì)引物（表2）：3對(duì)引物（A-2、A-3和A-7）的擴(kuò)增產(chǎn)物未包括缺失的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小無差異，不可用于區(qū)分缺失的位點(diǎn)；有5對(duì)引物（A-8、A-9、A-11、A-12和A-13）位于缺失內(nèi)，可單顯性擴(kuò)增出缺失序列，為顯性標(biāo)記引物，除A-13擴(kuò)增片段大、效果較差，其他均能準(zhǔn)確地判斷出果皮是否有色，但無色透明果皮和缺失數(shù)據(jù)無法區(qū)分；有8對(duì)（A-1、A-4、A-5、A-6、A-10、A-14、A-15和A-16）跨越缺失區(qū)域的引物，其中4對(duì)引物（A-5、A-6、A-15和A-16）擴(kuò)增產(chǎn)物偏大、效果較差，另外4對(duì)引物（A-1、A-4、A-10和A-14）可以共顯性標(biāo)記出缺失和非缺失2種基因型。由于缺失區(qū)域的GC含量偏低（A-10產(chǎn)物的GC含量為23%），導(dǎo)致PCR擴(kuò)增困難，常規(guī)的反應(yīng)體系和退火溫度在該區(qū)域經(jīng)常無法擴(kuò)增。利用P1（千禧，無色果皮）、P9（夏日陽光，純合有色果皮）、P5（F1雜合，有色果皮）3個(gè)材料作為功能標(biāo)記測試的供試材料，通過不同的退火溫度測試4對(duì)共顯性標(biāo)記，A-10的擴(kuò)增效果最好，最適合的退火溫度為58.6℃，最終選取A-10作為SIMYB12基因的分子功能標(biāo)記（圖3）。

表2 分子功能標(biāo)記的編號(hào)及序列信息

圖3 引物A-10不同退火溫度電泳結(jié)果

2.3 番茄種質(zhì)資源的分子鑒定

利用A-10分子功能標(biāo)記對(duì)30份種質(zhì)資源進(jìn)行基因型鑒定（圖4）。結(jié)果表明，30份番茄種質(zhì)資源中有18份（P1-P4、P10、P13、P16、P18、P19、P21-25、P27-P30）擴(kuò)增出約287 bp的特異性條帶，為純合隱性的缺失基因型，分子鑒定其果皮為無色透明果皮；3份材料（P9、P17和P20）擴(kuò)增出約890 bp的條帶，為純合顯性基因型，分子鑒定其果皮為有色果皮；還有9份（P5～P8，P11～P12，P14～P15，P26）同時(shí)擴(kuò)增出287和890 bp的條帶，說明控制果皮顏色的基因位點(diǎn)處于雜合的狀態(tài)，為雜合基因型，分子鑒定為有色果皮。

圖4 供試番茄材料A-10分子功能標(biāo)記電泳檢測

2.4 果皮顏色測定及分析

利用色差儀采集30份番茄種質(zhì)資源果實(shí)顏色的數(shù)據(jù)，獲得L、a、b、C和h測量值。Lab和LCh代表2個(gè)顏色空間，可以相互轉(zhuǎn)化。通過對(duì)果皮顏色在這兩個(gè)顏色空間進(jìn)行分析，最終使用三維坐標(biāo)對(duì)Lab進(jìn)行分析（圖5-A），將b≥45的果分類為有色果皮，b＜45的果歸類為透明果皮；Ch值采用二維坐標(biāo)分析（圖5-B），將色彩飽和度C≥60的分類為有色果皮，2種數(shù)據(jù)分析方法歸類結(jié)果一致。通過色差儀可以快速測出不同果皮顏色的測量值，并且使用Ch測量值即可區(qū)分大部分果皮的顏色。

圖5 三十份種質(zhì)資源的果皮顏色分析

2.5 功能標(biāo)記與目測法和儀器測試法的相關(guān)性分析

供試的材料中（表3），通過目測鑒定法，共有無色透明果皮18份，有色果皮12份；依據(jù)分子功能標(biāo)記的鑒定，隱性純合的無色透明果皮材料18份，有色果皮12份，其中顯性純合材料3份，雜合材料9份；依據(jù)Ch測量值，色差儀鑒定法鑒定的透明無色果皮20份，有色果皮10份。分子功能標(biāo)記的基因型與目測法的果皮顏色完全相符（相符率：100 %），分子功能標(biāo)記的基因型與Ch鑒定法鑒定的果皮顏色相符的有28份（相符率93.3%），不相符的2份（6.67%），不相符的材料為P7和P8。P7和P8為紫色番茄，在SIMYB12基因的缺失位點(diǎn)上為雜合型，果皮為有色果皮，但由于花青素含量高，呈現(xiàn)紫黑色，故色差儀測得其顏色飽和度C值及黃綠色b值較低。

表3 三十份番茄種質(zhì)資源分子鑒定法與目測鑒定法和儀器鑒定法的比較分析

3 討論與結(jié)論

在SIMYB12基因上游區(qū)域存在著影響功能的603 bp缺失序列[15-16]，是設(shè)計(jì)InDel分子功能標(biāo)記的理想?yún)^(qū)域。王仁漢等[18]參照祝光濤[15]設(shè)計(jì)的InDel分子標(biāo)記，對(duì)32份普通番茄材料進(jìn)行驗(yàn)證，有2份無法擴(kuò)增，并且對(duì)16份櫻桃番茄進(jìn)行檢測，其準(zhǔn)確率為62.5%。筆者在使用該InDel標(biāo)記時(shí)，也容易出現(xiàn)無法擴(kuò)增的情況。經(jīng)過序列分析，PCR反應(yīng)無法擴(kuò)增是該缺失區(qū)域的GC含量偏低所導(dǎo)致。因此，本研究的主要目的是在該位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)新的分子功能標(biāo)記，并優(yōu)化其PCR反應(yīng)體系，以期提高其檢出率和準(zhǔn)確性。該缺失區(qū)域的GC含量偏低，約為23%，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增較難，本研究設(shè)計(jì)的A-10分子功能標(biāo)記，最初利用15 μL常規(guī)的反應(yīng)體系也經(jīng)常出現(xiàn)材料無法擴(kuò)增的情形，后通過增加dNTPs的濃度到0.6μL，并嘗試調(diào)整不同的退火溫度。在使用退火溫度53℃時(shí)，雖然其結(jié)果的正確率提高到66.7%，但由于退火溫度較低，容易出現(xiàn)較多的副帶，產(chǎn)生假陽性的雜合帶型。最后通過調(diào)整退火溫度為58.6℃，使A-10分子功能標(biāo)記檢測準(zhǔn)確性提高到100%，解決缺失區(qū)域擴(kuò)增困難的問題。

紫色番茄P7和P8由于受到花青素代謝途徑合成基因的影響，花青素在其果皮上的積累，因此果實(shí)顏色呈現(xiàn)出紫色[19]。除了紫色番茄果皮顏色的分子檢測與色差儀采集數(shù)據(jù)存在不一致的情況外，其它顏色的番茄檢測結(jié)果均相符。本試驗(yàn)供試的2份紫色番茄材料的果皮為有色果皮，但色差儀的Lab或者Ch測量值均在無色透明果皮的標(biāo)定范圍內(nèi)，是花青素使果實(shí)呈現(xiàn)紫色[20]，紫色為紅色色相，導(dǎo)致色差儀顯示其b值偏向紅色；測量值小于45，或C值小于60，判斷為無色。在紫色番茄果皮顏色的測量中，色差儀的有色和無色果皮的閾值范圍，可使用有色果皮與無色果皮的紫色番茄材料作進(jìn)一步的測定和分類。但因目前本課題組收集的紫色番茄種質(zhì)資源僅有有色果皮的材料，故不能完成這部分對(duì)比試驗(yàn)。因此，對(duì)于紫色番茄的果皮顏色測定分類僅能通過傳統(tǒng)的目測鑒定法來完成。

傳統(tǒng)的番茄果皮顏色一般通過目測法簡單進(jìn)行區(qū)分和歸類，但是果皮顏色變異范圍極為廣泛，多呈連續(xù)性分布，直觀鑒定法易受人為因素的影響，不利于顏色的精確測量和分類，容易忽略一些中間的過渡；而儀器測定法中使用的色差儀自帶光源，不易受外界環(huán)境條件變化影響，能準(zhǔn)確測量有細(xì)微差別的2種顏色，而且具有操作便利、無損的特點(diǎn)。通過比較目測法和色差儀鑒定法測定結(jié)果與基因型的相符度可知，除了紫色番茄存在基因型與儀器測定法不一致外，其余的供試番茄材料中目測法和儀器測定法測定結(jié)果與基因型的檢測結(jié)果均一致，表明儀器測定法可用于非紫色番茄的測定，且能夠更精準(zhǔn)地測定不同果皮的顏色并進(jìn)行歸類。由于SIMYB12基因存在著多個(gè)突變的位點(diǎn)，不同的單倍型對(duì)果皮顏色的影響不盡相同，本研究僅在603 bp缺失位點(diǎn)開發(fā)的功能標(biāo)記A-10雖不能完全代表不同的果皮顏色，但可用于大部分種質(zhì)資源的鑒定。因此，在針對(duì)番茄果皮顏色的分子標(biāo)記輔助育種方面，本研究結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。