焦萬明 ，馬 園 ，尹衍峰 ，付 偉 ，賈曉晴 ，馬俊杰 ，丁玉林 ，杜 山 ，王 瑞 *

（1.內(nèi)蒙古阿拉善盟額濟(jì)納旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 阿拉善 735400；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.濟(jì)南市長清區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 濟(jì)南 250399）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲?。℉aemonchosis）是一種由圓線目（Strongylata），毛圓科 （Trachostrongylidae），血矛屬（Haemonchus）的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchxs contortus）引起的寄生蟲病[1]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種小反芻動(dòng)物的寄生線蟲，分布于世界各地，以寄主血液為食，可導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重貧血甚至死亡[2]。目前，使用胃腸驅(qū)蟲藥仍是針對(duì)該病的首選治療手段，但是由于耐藥情況日益嚴(yán)重，迫使我們急需開發(fā)新的藥物或者更好地改進(jìn)防控策略，如研制寄生蟲疫苗、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等[3]。

近年來，針對(duì)寄生蟲病基因工程疫苗的研究已成為熱點(diǎn)，其中選擇合適且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原蛋白是關(guān)鍵因素之一。目前，針對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病研制的重組抗原疫苗所進(jìn)行的免疫試驗(yàn)均未取得理想效果[4]。新發(fā)現(xiàn)的Hc-dhs-28蛋白是Ce-dhs-28蛋白的同系物，Ce-dhs-28蛋白是氧化循環(huán)中的關(guān)鍵酶，該蛋白質(zhì)含有短鏈脫氫酶結(jié)構(gòu)域和過氧化物酶體靶向信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)Hc-dhs-28蛋白最有可能作為第3種3-羥?；o酶A脫氫酶參與過氧化物酶體脂肪酸B的氧化，從而調(diào)節(jié)與滯育相關(guān)的信息素的產(chǎn)生，進(jìn)而影響捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的滯育形成[5-6]。

本研究利用生物信息學(xué)工具及在線分析軟件對(duì)Hc-dhs-28蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等進(jìn)行分析，進(jìn)而確定Hc-dhs-28抗原的B細(xì)胞表位，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的進(jìn)一步免疫診斷和疫苗研制提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 目的基因信息

在GenBank上獲取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-dhs-28基因序列，編碼438個(gè)氨基酸（序列號(hào)：AVP73885.1）。

1.2 試驗(yàn)方法

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析：通過Expasy軟件中Protparam在線工具分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)[7]。跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號(hào)肽預(yù)測：采用TMHMM Server v.2.0、Signa1P4.1Server和 ProScale在線工具對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測[8-9]。磷酸化和亞細(xì)胞定位預(yù)測：通過NetPhos和PSORT Ⅱ在線工具對(duì)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測[10]。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測：使用SOPMA和Phyre2在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析并建模[11]。B細(xì)胞表位預(yù)測：使用IEDB Analysis Resource在線工具預(yù)測B細(xì)胞表位[12]。具體網(wǎng)址如表1所示。

表1 在線工具及網(wǎng)址

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)

Hc-dhs-28蛋白的氨基酸組成見表2。Hc-dhs-28蛋白由438個(gè)氨基酸組成，其中占比最高的氨基酸為丙氨酸 （Ala，10%）。 蛋白分子式為 C2088H3339N569O640S17，相對(duì)分子質(zhì)量為47198.93，理論等電點(diǎn)為8.77，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為46個(gè)，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為51個(gè)。預(yù)測的半衰期為30h（哺乳動(dòng)物體內(nèi)），脂溶指數(shù)為86.57，親水性總平均值為-0.169，脂肪指數(shù)為85.53，不穩(wěn)定性指數(shù)為32.32，判定該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

表2 Hc-dhs-28蛋白的氨基酸組成表

2.2 跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果如圖1所示。如果蛋白質(zhì)包含跨膜區(qū)，則它可作為膜受體發(fā)揮作用，或是位于膜上的錨定蛋白和離子通道蛋白[13]。由TMHMM軟件分析可知，Hc-dhs-28蛋白預(yù)測結(jié)果均位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖1 Hc-dhs-28蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白親疏水性分析結(jié)果如圖2所示。多肽鏈的親疏水性在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中具有十分重要的作用。由ProScale軟件分析可知，Hc-dhs-28蛋白的平均親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.169，該蛋白存在的親水性氨基酸數(shù)量>疏水性氨基酸數(shù)量，最大值為2.256，位于第139位（Lys），具有較強(qiáng)的疏水性。親水性最小值為-2.544，位于第348位（Ile），具有較好的親水性，分析該蛋白為親水蛋白。

圖2 Hc-dhs-28蛋白親疏水性分析結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果如圖3所示。采用Signa1P軟件分析Hc-dhs-28蛋白是否存在信號(hào)肽，根據(jù)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號(hào)肽存在，表明其為非分泌型蛋白。

圖3 Hc-dhs-28蛋白信號(hào)肽分析結(jié)果

2.3 磷酸化和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白磷酸化分析結(jié)果如圖4所示。蛋白質(zhì)磷酸化是一種翻譯后修飾，磷酸化主要集中在Tyr、Thr和Ser殘基上，這些殘基具有游離羥基且不帶電荷。經(jīng)過磷酸化后的蛋白質(zhì)帶電荷，使得其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并由此導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的改變[14]。通過NetPhos3.1在線工具分析得知，Hc-dhs-28氨基酸序列含有43個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為24個(gè)絲氨酸、14個(gè)蘇氨酸和5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。采用PSORT Ⅱ在線工具對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白可能主要在線粒體上發(fā)揮生物學(xué)作用。

圖4 Hc-dhs-28蛋白磷酸化分析結(jié)果

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

Hc-dhs-28蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖5所示。使用SOPMA軟件預(yù)測Hc-dhs-28蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比最高為39.95%，β-轉(zhuǎn)角占比最少為7.31%，無規(guī)則卷曲占比34.47%，β-折疊占比18.26%。α-螺旋和β-折疊被認(rèn)為是蛋白的骨架區(qū)域，由于2種結(jié)構(gòu)的特殊性，這2個(gè)區(qū)域不利于形成位點(diǎn)。根據(jù)Hcdhs-28蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，雖然α-折疊占比較高，但是結(jié)合其親疏水性，預(yù)測Hc-dhs-28蛋白上存在多個(gè)抗原位點(diǎn)。

圖5 Hc-dhs-28蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果

2.5 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

Phyre2是一套可在網(wǎng)絡(luò)上使用的生物信息學(xué)工具，用于預(yù)測和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和突變[11]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的準(zhǔn)確性關(guān)鍵取決于查詢序列和模板序列之間的相似性，如果待檢測的模板與查詢的序列同一性大于30%，那么通常大部分或全部比對(duì)將是準(zhǔn)確的，并且由此產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)元素在模型中的相對(duì)位置將是可靠的。低于這個(gè)序列同一性水平，Phyre通常會(huì)進(jìn)行自行匹配。如果置信度匹配度高于90%，模型的整體折疊可以肯定是正確的，并且模型的結(jié)構(gòu)元素在模型中的相對(duì)位置將是趨于準(zhǔn)確的[15]。

Hc-dhs-28蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖6所示。使用Phyre2軟件預(yù)測Hc-dhs-28蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可知，Hc-dhs-28蛋白模型基于模板c1zbqB_，297個(gè)殘基（序列的68%）通過單個(gè)最高評(píng)分模板以100.0% 的置信度建模。Hc-dhs-28蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，其次是β-折疊，與SOPMA預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

圖6 Hc-dhs-28蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

2.6 B細(xì)胞表面抗原表位預(yù)測

IEDB在線軟件通過6個(gè)方面 （線性表位、β-折疊、表面可及性、靈活性、抗原指數(shù)和親水性）的預(yù)測確定蛋白的抗原表位。Hc-dhs-28蛋白的預(yù)測結(jié)果如圖7所示，綜合二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，去除α-螺旋、β-折疊和疏水區(qū)等不易形成表位的區(qū)域，分析確定了5個(gè)B細(xì)胞表位，結(jié)果見表3。

圖7 Hc-dhs-28蛋白B細(xì)胞表位抗原結(jié)果

表3 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

3 討論

開發(fā)針對(duì)寄生線蟲的商業(yè)疫苗，一個(gè)主要障礙是難以獲得能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫重組形式的保護(hù)性抗原。目前，疫苗接種研究受到從寄生蟲提取物中純化的天然蛋白質(zhì)含量低、對(duì)寄生蟲材料的需求量大以及這種方法的成本、安全性和倫理考慮的限制，迫切需要發(fā)現(xiàn)特定亞單位疫苗的替代方法[16]。

在世界范圍內(nèi)，家畜寄生線蟲依然是嚴(yán)重危害全球畜牧業(yè)生產(chǎn)的一類疫病。由于寄生蟲病控制目前仍依賴于使用驅(qū)蟲藥，但是寄生蟲抗藥性問題越來越普遍，意味著這種方法可能已不可持續(xù)[17]。雖也有資料報(bào)道，氨基乙腈衍生物的出現(xiàn)提供了一種替代方法，但其在使用不到2年的時(shí)間里，已有報(bào)告稱感染羊的線蟲對(duì)這種新型藥物便產(chǎn)生了耐藥性[18]。有研究表明，使用天然蛋白提取物接種疫苗后，對(duì)家畜線蟲感染具有顯著的保護(hù)作用，證明接種疫苗是可行的[19]。但是目前針對(duì)寄生線蟲的基因工程疫苗較少，許多研究都還在試驗(yàn)階段，因此選擇合適的抗原來制備疫苗變得尤為關(guān)鍵。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的許多抗原被普遍用于防治試驗(yàn)，但隨著研究的深入，由于蛋白表達(dá)量低、蛋白空間結(jié)構(gòu)折疊出現(xiàn)錯(cuò)誤以及不能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)蟲體的保護(hù)性免疫等原因，需選擇合適的抗原進(jìn)行表達(dá)[20]。有研究顯示，Hc-dhs-28重組蛋白具有較好的免疫原性，對(duì)宿主具有較好的免疫保護(hù)效力，是一種潛在的疫苗候選因子，Hc-dhs-28主要在幼蟲自由生活期轉(zhuǎn)錄，在滯育期達(dá)到高峰。在寄生蟲自由生活的早期階段，為進(jìn)入滯育階段做好準(zhǔn)備而激活滯育形成。這些結(jié)果表明，Hc-dhs-28蛋白可能參與滯育的形成[21-22]。

本文分析了Hc-dhs-28蛋白理化特性、結(jié)構(gòu)和抗原表位，顯示Hc-dhs-28蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性、非分泌型的穩(wěn)定蛋白，存在磷酸化位點(diǎn)，主要在線粒體發(fā)揮其生物學(xué)作用。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)工具預(yù)測結(jié)合其二級(jí)結(jié)構(gòu)，確定了5個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢表位。這些結(jié)果表明，Hc-dhs-28蛋白有很好的應(yīng)用價(jià)值，具有作為抗原的潛質(zhì)，表明后期可選擇其合適的短肽進(jìn)行表達(dá)，深入分析該蛋白的功能，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的高效安全防控提供理論依據(jù)。