陳 烈，王智超，劉 霖，朱夢莉

臨床通過各種治療手段恢復(fù)梗死相關(guān)冠狀動脈血流后，伴隨心肌損害、心電功能障礙進行性加重的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。有研究顯示，炎癥反應(yīng)是MIRI中的重要一環(huán)，炎癥反應(yīng)的輕重與心肌梗死后細胞壞死的程度有關(guān)[1]。核因子κB(NF-κB)作為MIRI炎癥介質(zhì)表達的始動因素，在各種刺激下NF-κB的活化誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α(TNF-α)等相關(guān)炎性因子表達，通過炎癥反應(yīng)介導(dǎo)MIRI[2]。Toll樣受體4(TLR4)作為NF-κB的上游因子，參與了這一過程。目前將TLR4/NF-κB通路作為缺血再灌注損傷的治療靶點，已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3]。本研究以參附注射液為干預(yù)藥物，通過比較各組大鼠血清TNF-α、白細胞介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平及心肌組織NF-κB、TLR4 mRNA及蛋白表達變化，探討其抗MIRI的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心提供的60只健康無特定病原體(SPF)級成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，采用隨機數(shù)字表法分為對照組(10只)、假手術(shù)組(10只)、模型組(20只)和參附組(20只)，動物合格證號No.42000600019496，動物設(shè)施使用證號No.00184771。

1.2 藥物與給藥方法 參附注射液由紅參、附片提取而成，主要成分為人參皂苷和烏頭堿，由華潤三九(雅安)藥業(yè)有限公司提供(批號：Z51020664)。參附組分別于實驗前1 d、實驗前1 h和實驗術(shù)后1 h尾靜脈給藥，共給藥3次，參附注射液劑量為10 mg/kg；對照組給予對應(yīng)等體積生理鹽水。

1.3 實驗試劑與儀器 全蛋白提取試劑盒KGP2100購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，組織總RNA提取試劑盒購自天根生物試劑有限公司，Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega，兔抗大鼠TLR4抗體、NF-κB抗體購自Santa Cruz生物科技公司，余主要試劑購自美國Cell Signaling Technology公司。儀器：QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀、EDC-810 PCR儀、JY02S紫外分析儀、Nano-100微量分光光度計、ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱、C2500-R-230V微型高速離心機等。

1.4 MIRI模型制備 實驗前大鼠禁食12 h，模型制備方法參照相關(guān)文獻[4]，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，氣管插管、呼吸機支持通氣，標準Ⅱ?qū)?lián)記錄大鼠心電圖，于左胸前第4肋間、第5肋間橫向剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，剪開心包膜，暴露心臟，于冠狀動脈左前降支起始部下2～3 mm處進針，結(jié)扎冠狀動脈左前降支引起心肌缺血，結(jié)扎后Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高>0.1 mV或T波高聳及心肌顏色變暗紅，提示結(jié)扎成功。缺血30 min后放松結(jié)扎線后以ST段降低1/2以上、心肌顏色變紅潤提示再灌注成功，再灌注持續(xù)時間為60 min。假手術(shù)組大鼠除穿針不予結(jié)扎外其他處理均相同。

1.5 觀察指標

1.5.1 血清指標測定 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量，參照試劑盒說明。

1.5.2 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測心肌組織TLR4和NF-κB mRNA表達 采用TRIZOL提取樣本中總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。每管取1 μg總RNA溶液，進行逆轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄、預(yù)變性、變性、退火和延伸等)。按說明書在ABI7500熒光實時定量儀上進行定量檢測。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。使用7300SDSv2.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，計算不同樣本中TLR4和NF-κB mRNA表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.3 免疫印跡法(Western Blot)測定心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達 提取樣本蛋白樣品，配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，通過電泳將蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE上進行分離。轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色成像。采用Image-Pro Plus(version 4.1)軟件分析蛋白條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA=A×面積)，以靶蛋白IA值/β-肌動蛋白IA值比值作為TLR4、NF-κB蛋白的表達。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；參附組TNF-α、IL-6、CRP水平較模型組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.2 各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4 mRNA表達比較 模型組心肌組織NF-κB、TLR4 mRNA表達較對照組均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；參附組NF-κB、TLR4 mRNA表達較模型組均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4 mRNA表達比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4蛋白表達比較 模型組心肌組織NF-κB、TLR4蛋白表達較對照組均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；參附組NF-κB、TLR4蛋白表達較模型組均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖1。

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4蛋白表達比較(±s)

圖1 各組大鼠心肌組織NF-κB、TLR4蛋白表達條帶圖

3 討 論

MIRI已成為阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題。相關(guān)研究顯示，MIRI病理機制相對復(fù)雜，炎癥反應(yīng)作為MIRI重要病理機制之一，伴隨整個MIRI過程，干預(yù)炎癥反應(yīng)，對改善心臟功能具有重要意義[5-6]。機體在心肌缺血再灌注刺激下活化NF-κB因子并誘導(dǎo)表達TNF-α、IL-6等多種炎性因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌損傷，病理表現(xiàn)為心肌細胞被大量炎性細胞浸潤，同時再灌注又可加重急性心肌炎癥反應(yīng)程度，進一步加重炎癥反應(yīng)[7]。

NF-κB是由NF-κB基因編碼，一類具有多向調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，成員包括p50、p52、p65/RelA、RelB及c-Rel，參與炎癥反應(yīng)、細胞鈣穩(wěn)態(tài)、細胞分化和增殖、細胞凋亡等多個病理生理過程，在維持機體正常生理功能中發(fā)揮著重要的作用，其中以p50與p65兩個亞型與心血管系統(tǒng)關(guān)系密切。李郁等[8]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控NF-κB信號通路對心肌的保護作用，證實該信號通路在MIRI發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關(guān)蛋白，作為固有免疫應(yīng)答的代表性受體之一，廣泛存在于心肌細胞膜上，參與多種生理病理過程[9-10]。有研究顯示，缺血再灌注損傷時，TLR4為NF-κB的上游因子，通過識別多種內(nèi)源性配體及細胞外基質(zhì)的某些成分，活化NF-κB信號通路，NF-κB進入細胞核，調(diào)節(jié)促炎基因等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進TNF-α、IL-6、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素8(IL-8)等多種炎性因子的活化和表達，介導(dǎo)炎癥損傷[11-13]。TNF-α作為機體受到有害刺激后最初分泌的重要炎性因子，可啟動NF-κB信號通路活化后炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進一步促進多種炎性因子表達，引發(fā)炎癥風(fēng)暴，造成炎癥損傷，進一步導(dǎo)致心肌細胞凋亡[14-16]。TNF-α、IL-6作為缺血再灌注損傷中的重要炎癥介質(zhì)，其水平高低可反映炎癥反應(yīng)程度，與缺血再灌注的損害程度呈正相關(guān)。多項研究顯示，應(yīng)用TLR4拮抗劑可減輕心肌組織NF-κB活化程度，縮小心肌梗死面積，減輕炎癥反應(yīng)，通過調(diào)控TLR4表達，可減輕心肌缺血再灌注所致心肌損傷，改善心臟功能[17-18]。

參附注射液是由中藥紅參、附片提取制備而成，具有回陽救逆之功效?，F(xiàn)代藥理研究認為，附子含有多種生物堿，能興奮和激動β受體，釋放兒茶酚胺，發(fā)揮強心、抗心律失常及抗氧化作用[19]。另一項實驗發(fā)現(xiàn)，附子多糖具有抗細胞凋亡作用，可能與調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB有關(guān)[20]；紅參多含有人參皂苷，具有抗氧化、抗衰竭、改善心肌缺血等作用。本研究結(jié)果顯示，參附注射液干預(yù)心肌缺血再灌注大鼠，可降低大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量，減輕炎癥反應(yīng)，同時參附注射液干預(yù)后NF-κB，TLR4 mRNA及蛋白表達水平較模型組均下降。

參附注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與調(diào)控TLR4/NF-κB通路、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。