陳 靜，李 芹

溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療及時恢復(fù)冠狀動脈血流是減輕急性心肌缺血損傷，降低死亡率的有效策略，然而再灌注可誘發(fā)心肌缺血/再灌注(I/R)損傷。氧化應(yīng)激、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)是I/R發(fā)生的關(guān)鍵因素[1]。因此，針對上述因素制定有效的干預(yù)措施或策略對防止心肌I/R損傷具有重要的臨床意義。相關(guān)研究顯示，藥物預(yù)處理是一種有效的心肌保護手段，可增強機體對I/R耐受能力，縮小心肌損傷面積，改善預(yù)后[2]。木棉花是木棉科木棉屬植物木棉Bombax malabaricum DC.的干燥花，富含總黃酮、多糖等化學(xué)成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂、降血糖、保肝等藥理活性，是中藥方劑、涼茶的重要原料[3]。相關(guān)研究顯示，木棉花提取物可清除內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧，抑制氧化應(yīng)激，對過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用[4]。木棉花提取物通過調(diào)控微小RNA(miR)-30b-3p表達可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞炎癥反應(yīng)和細胞凋亡[5]。然而木棉花提取物對心肌細胞I/R損傷的影響尚未明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是人類基因組中新發(fā)現(xiàn)的一類包含大于200個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄本，其在細胞分化、增殖、凋亡和炎癥等生理過程中發(fā)揮著重要作用，lncRNA表達改變與心肌I/R損傷相關(guān)[6]。有研究顯示，心肌缺血病人血清2號染色體表達的腫瘤相關(guān)lncRNA(TALNEC2)表達上調(diào)，過表達lncRNA TALNEC2可激活Wnt/β-catenin通路，加重心肌細胞缺氧損傷，是心肌缺血的潛在治療靶點[7]。但lncRNA TALNEC2在心肌I/R損傷中的作用尚未明確。本研究通過建立H9c2心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型模擬心肌I/R損傷過程[8]，探討木棉花提取物對心肌I/R損傷的保護作用，并通過lncRNA TALNEC2探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞H9c2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；木棉由醫(yī)院中藥房提供；Lipofectamine 2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自上海貝博生物公司；lncRNA TALNEC2的小干擾RNA(si-lncRNA TALNEC2)及其陰性對照(si-NC)、lncRNA TALNEC2的過表達載體(pcDNA-lncRNA TALNEC2)、空載體質(zhì)粒(pcDNA)購自上海生工生物公司；丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶生物公司；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技公司；β-actin兔多克隆抗體、Bax兔單克隆抗體(ab32503)、Cleaved-Caspase-3兔單克隆抗體(ab32042)、山羊抗兔IgG二抗(ab205781)購自美國Abcam公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自大連Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 木棉花提取物的制備 參照文獻[5]方法制備木棉花提取物：取干燥木棉花，按照料液比1∶40加入60%乙醇，微波(240 W)處理2 min，減壓濃縮，40%NaOH調(diào)節(jié)pH值至9～10，靜置1 h，3 500 r/min離心15 min。收集上清液，石油醚萃取2次，取水相用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取上清液用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相進行濃縮干燥即為木棉花提取物浸膏。采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法在500 nm下測定木棉花提取物含量，以蘆丁為對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)測定浸膏中木棉花總黃酮含量占45.68%。使用無血清DMEM培養(yǎng)基配制木棉花提取物為不同實驗濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng) H9c2細胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置入含5%CO2、95%空氣、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞80%匯合時，按照1∶4比例傳代，取第3代對數(shù)期細胞進行實驗。

1.2.3 CCK-8法檢測木棉花提取物對H9c2細胞的毒性作用 將H9c2細胞以每孔5×103個密度接種到96孔板，細胞貼壁后，更換為木棉花提取物終濃度為10 mg/L(低劑量組)、40 mg/L(中劑量組)、60 mg/L(高劑量組)的培養(yǎng)液[4]孵育細胞24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱孵育2.5 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A)值。

1.2.4 模型構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、實驗分組 參照文獻[8]方法建立心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，將H9c2細胞接種于無血清培養(yǎng)基并置于缺氧密閉裝置中培養(yǎng)6 h，缺氧培養(yǎng)后更換為含10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)基于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

細胞轉(zhuǎn)染：將H9c2細胞按照每孔2×105個的密度接種于6孔板，利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染si-lncRNA TALNEC2、si-NC、pcDNA-lncRNA TALNEC2、pcDNA至50%匯合細胞，轉(zhuǎn)染48 h時收集細胞進行后續(xù)實驗。

實驗分組：對照組為正常培養(yǎng)的H9c2細胞；模型組缺氧/復(fù)氧處理的H9c2細胞；低劑量+模型組、中劑量+模型組、高劑量+模型組在缺氧/復(fù)氧處理前，分別給予H9c2細胞木棉花提取物終濃度為10 mg/L、40 mg/L、60 mg/L的培養(yǎng)液處理24 h[4]，其余操作同模型組；si-NC+模型組、si-lncRNA TALNEC2+模型組將轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-lncRNA TALNEC2的H9c2細胞進行缺氧/復(fù)氧處理。pcDNA+高劑量+模型組、pcDNA-lncRNA TALNEC2+高劑量+模型組于缺氧/復(fù)氧處理前，給予轉(zhuǎn)染pcDNA、轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA TALNEC2的H9c2細胞木棉花提取物終濃度為60 mg/L的培養(yǎng)液處理24 h，其余操作同模型組。

1.2.5 酶標(biāo)法檢測SOD和LDH活力、MDA含量 H9c2細胞處理后，分別收集細胞和培養(yǎng)液上清液至干凈的離心管中。采用LDH活性檢測試劑盒分析培養(yǎng)液上清液LDH活力，向細胞沉淀中加入提取液，超聲破碎細胞，收集細胞上清液，采用MDA檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒測定細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組H9c2細胞收集在5 mL離心管中，使用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次，并用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞終濃度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液至流式管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室溫避光孵育15 min，再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液輕輕混勻。1 h內(nèi)采用流式細胞儀分析各組細胞樣品凋亡情況。

1.2.7 蛋白免疫印記法檢測Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達 RIPA緩沖液提取各組H9c2細胞總蛋白，細胞蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，將膜與Bax、Cleaved-Caspase-3、β-actin特異性一抗孵育，稀釋比例為1∶1 000。4 ℃過夜孵育后，使用對應(yīng)的抗兔IgG二抗室溫孵育膜2 h。將PVDF膜置于保鮮膜上，加入滴加化學(xué)發(fā)光試劑，并轉(zhuǎn)移膜至凝膠成像儀中曝光顯影，采用Image Lab軟件分析目的條帶的相對灰度值。

1.2.8 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測lncRNA TALNEC2表達 Trizol試劑提取各組培養(yǎng)細胞總RNA，用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq進行RT-qPCR分析lncRNA TALNEC2表達。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算lncRNA TALNEC2相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度木棉花提取物對心肌細胞H9c2毒性的影響 與對照組比較，不同濃度木棉花提取物處理后H9c2細胞活力無變化，提示10 ～160 mg/L木棉花提取物對H9c2無毒性作用。詳見表1。

表1 不同濃度木棉花提取物對心肌細胞H9c2毒性的影響(±s，n=9)

2.2 木棉花提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激損傷的影響 與對照組比較，模型組H9c2細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達量、培養(yǎng)液LDH活性增加(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量+模型組、中劑量+模型組、高劑量+模型組H9c2細胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達量、培養(yǎng)液LDH活性降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。詳見圖1和表2。

圖1 木棉花提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細胞H9c2氧化應(yīng)激損傷的影響(A為流式細胞儀檢測細胞凋亡；B為Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達條帶圖)

2.3 木棉花提取物對lncRNA TALNEC2表達的影響 與對照組比較，模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2相對水平升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量+模型組、中劑量+模型組、高劑量+模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2相對水平降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 木棉花提取物對lncRNA TALNEC2表達的影響(±s)

2.4 下調(diào)lncRNA TALNEC2表達對缺氧/復(fù)氧心肌細胞H9c2氧化應(yīng)激損傷的影響 與si-NC+模型組比較，si-lncRNA TALNEC2+模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2相對水平降低(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達量、培養(yǎng)液中LDH活性降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。詳見圖2和表4。

圖2 Western Blot檢測Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白的表達

2.5 lncRNA TALNEC2逆轉(zhuǎn)木棉花提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細胞H9c2氧化應(yīng)激損傷的影響 與pcDNA+高劑量+模型組比較，pcDNA-lncRNA TALNEC2+高劑量+模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2水平升高(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達量、培養(yǎng)液LDH活性升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。詳見圖3和表5。

圖3 兩組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達條帶圖

3 討 論

H9c2細胞是來源于胚胎大鼠心臟組織的亞克隆細胞株，已廣泛用于建立缺氧/復(fù)氧損傷細胞模型[9-10]。本研究中低劑量、中劑量、高劑量的木棉花提取物預(yù)處理對H9c2細胞活力影響不大，表明木棉花提取物對H9c2細胞無毒性作用。心肌在I/R過程中產(chǎn)生大量活性氧，并攻擊生物膜，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA產(chǎn)生，促進LDH釋放，SOD等抗氧化酶可清除活性氧，在預(yù)防脂質(zhì)過氧化和心肌細胞損傷過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。本研究中，缺氧/復(fù)氧處理可增加H9c2細胞MDA含量，降低SOD活性，增加細胞培養(yǎng)液LDH活性。本研究中木棉花提取物預(yù)處理可有效緩解缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，與盧秋玉等[4]報道的抗氧化損傷作用一致。心肌I/R后心肌細胞凋亡增加。本研究中木棉花提取物預(yù)處理可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞凋亡。Bax是Bcl-2家族的重要成員，受到凋亡刺激時Bax移位至線粒體導(dǎo)致細胞色素C釋放，引發(fā)Caspase-9活化，并激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，發(fā)揮促凋亡功能[13]。本研究中木棉花提取物預(yù)處理可降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax表達上調(diào)，與木棉花提取物的抗凋亡作用一致。上述研究結(jié)果表明，木棉花提取物通過抑制細胞凋亡和氧化應(yīng)激，對缺氧/復(fù)氧心肌細胞損傷發(fā)揮保護作用。

lncRNA參與調(diào)控心肌細胞凋亡、自噬、壞死、氧化應(yīng)激、炎癥和線粒體功能障礙，在心肌I/R發(fā)生、進展中發(fā)揮著重要作用，具有治療心肌I/R損傷的潛力[14]。lncRNA TALNEC2最初被證實參與膠質(zhì)瘤、乳腺癌進展，下調(diào)lncRNA TALNEC2，阻滯癌細胞周期至G0/G1期，抑制癌細胞增殖能力[15-16]。有研究顯示，腦I/R術(shù)后小鼠大腦中糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)母細胞瘤細胞N2a中l(wèi)ncRNA TALNEC2表達上調(diào)，敲減lncRNA TALNEC2可抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的N2a細胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)I/R誘導(dǎo)的腦損傷和神經(jīng)功能障礙[17]。淫羊藿苷通過下調(diào)lncRNA TALNEC2表達減輕缺氧誘導(dǎo)的成骨細胞損傷[18]。本研究中缺氧/復(fù)氧處理可增加H9c2中l(wèi)ncRNA TALNEC2表達水平，木棉花提取物預(yù)處理可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的lncRNA TALNEC2表達上調(diào)，提示lncRNA TALNEC2表達可能介導(dǎo)木棉花提取物對H9c2細胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用。驗證lncRNA TALNEC2功能顯示，下調(diào)lncRNA TALNEC2表達可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞凋亡，增加SOD活性，降低MDA含量，并抑制LDH釋放，保護H9c2細胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，與木棉花提取物預(yù)處理的保護作用相近。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA TALNEC2可削弱木棉花提取物預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧H9c2細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響，表明木棉花提取物通過下調(diào)lncRNA TALNEC2表達，對缺氧/復(fù)氧心肌細胞氧化損傷發(fā)揮保護作用。

總之，木棉花提取物可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷，其機制是通過下調(diào)lncRNA TALNEC2表達實現(xiàn)的，初步揭示了木棉花提取物的心肌保護機制，為木棉花提取物防治心肌I/R損傷提供了實驗依據(jù)。