蘭真真，瞿惠燕，戎靖楓，楊 濤，楊曉利，周 華

慢性心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的復雜臨床綜合征，為各種心臟疾病的終末階段，因具有較高的發(fā)生率與死亡率，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。據(jù)統(tǒng)計，心力衰竭病人平均每日至少需使用5種處方藥物，加重了病人經(jīng)濟負擔，疊加了藥物不良反應[2-3]。中藥復方因多成分、多靶點、多通路等特點，治療慢性心力衰竭等機制復雜的慢性疾病具有獨特優(yōu)勢。由于中藥多成分等復雜性使其主要療效物質(zhì)及機制不明確，導致中藥不能被廣泛接受和應用。

網(wǎng)絡藥理學是一門以系統(tǒng)生物學、生物信息學和高通量組織學為基礎，集藥理學和信息網(wǎng)絡為一體的綜合學科。通過網(wǎng)絡生物學與多元藥理學結(jié)合，系統(tǒng)分析藥物治療疾病網(wǎng)絡的干預機制[4]。由此可見，網(wǎng)絡藥理學的系統(tǒng)特征與中醫(yī)藥的整體觀念和辨證論治理論一致，使其成為研究中醫(yī)藥機制的最佳工具。

鹿角方(專利號：ZL 2006 1 0147305.0)是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科治療心力衰竭的常用方，因其良好的臨床療效已在臨床應用數(shù)十年。相關研究證實，鹿角方可增強心臟收縮功能，顯著改善心力衰竭病人臨床癥狀[5-6]，但作用機制尚未明確。本研究旨在運用網(wǎng)絡藥理學探討鹿角方治療慢性心力衰竭的潛在靶點及作用機制，為鹿角方進一步應用與研究提供科學的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 鹿角方成分靶點的篩選 中藥成分復雜，一般認為被吸收入血的成分才可發(fā)揮作用。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)鑒定出鹿角方的6種入血成分為補骨脂素、異補骨脂素、馬錢苷、莫諾苷、紅景天苷、寶霍苷Ⅰ[7]。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取上述6種成分的2D化學結(jié)構(gòu)式，通過化學結(jié)構(gòu)式在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索相關靶點。

1.2 慢性心力衰竭靶點的篩選 以“chronic cardiac failure”“chronic heart failure”為關鍵詞，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中收集匯總慢性心力衰竭的相關靶點。

1.3 蛋白-蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線作圖平臺對鹿角方作用靶點與慢性心力衰竭相關靶點取交集，并繪制韋恩圖。將交集靶點提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互作得分(highest confidence)設定為0.9，其余設置均為默認值，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡模型。其中節(jié)點(node)表示靶點，邊(edge)表示靶點間的關系。根據(jù)網(wǎng)絡拓撲參數(shù)篩選關鍵靶點。

1.4 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 為闡述潛在靶點的生物學效應及在信號通路中的作用，將鹿角方與慢性心力衰竭交集靶點提交至DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，設定靶點為“official gene symbol”，生物種類設定為“Homo sapiens”，閾值P<0.05，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO功能富集分析結(jié)果以條形柱狀圖形式呈現(xiàn)；KEGG分析結(jié)果以氣泡圖和表格形式呈現(xiàn)。

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 運用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，利用Network Analysis工具進行網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等，根據(jù)度值篩選鹿角方的主要活性成分。

2 結(jié) 果

2.1 鹿角方相關作用靶點 經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫篩選，其中，補骨脂素有效靶點20個、異補骨脂素有效靶點20個、馬錢苷有效靶點39個、莫諾苷有效靶點21個、紅景天苷有效靶點23個、寶霍苷Ⅰ有效靶點23個，合并后刪除重復值共得到有效靶點71個。

2.2 慢性心力衰竭相關靶點 從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得慢性心力衰竭靶點9 300個。根據(jù)經(jīng)驗，疾病靶點過多時，設定Score大于中位數(shù)為疾病的潛在靶點。9 300個靶點中Score最大為108.43，最小為0.13，計算中位數(shù)為3.67，故設定Score≥3.67的靶點為慢性心力衰竭的主要潛在靶點。結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫補充相關靶點，合并后刪除重復值共得到慢性心力衰竭相關靶點4 655個。

2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 通過Venn平臺繪制鹿角方與慢性心力衰竭作用靶點韋恩圖，得到交集靶點47個，詳見圖1。將藥物與疾病交集靶點提交至STRING 11.0平臺，得到藥物與疾病交集靶點的PPI網(wǎng)絡，詳見圖2。去除游離節(jié)點后，網(wǎng)絡中節(jié)點39個、邊113條，平均節(jié)點度值4.81，平均局部聚類系數(shù)0.389，其中蛋白激酶C(PRKCA)、腎上腺素能受體2A(ADRA2A)、腎上腺素能受體2C(ADRA2C)、糖原合酶激酶3β(GSK3B)、細胞色素P450 1B1(CYP1B1)、蛋白激酶Cε(PRKCE)、B細胞κ輕肽基因增強子核因子1(NFKB1)、腺苷酸激酶(ADK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)度值和聚類系數(shù)均大于均值，為鹿角方治療慢性心力衰竭的關鍵靶點，詳見表1。

圖1 鹿角方-慢性心力衰竭韋恩圖

圖2 藥物與疾病交集靶點的PPI網(wǎng)絡圖

表1 關鍵靶點網(wǎng)絡節(jié)點參數(shù)

2.4 GO功能富集分析 應用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO功能富集分析。結(jié)果顯示，47個靶點富集于102個生物學過程(GO-BP)。其中，與慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關的有氧化還原反應(oxidation-reduction process)、對缺氧的反應(response to hypoxia)和MAP激酶活性的正調(diào)控(positive regulation of MAP kinase activity)等。細胞成分(GO-CC)主要涉及細胞質(zhì)(cytoplasm)、質(zhì)膜(plasma membrane)、外泌體(extracellular exosome)、線粒體(mitochondrion)等。分子功能(GO-MF)主要富集于ATP結(jié)合(ATP binding)、蛋白質(zhì)均二聚活性(protein homodimerization activity)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等，詳見圖3。

圖3 GO富集分析條形柱狀圖

2.5 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析顯示，47個靶點富集于50條通路。其中，與慢性心力衰竭密切相關的有胰島素抵抗通路(insulin resistance pathway)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、血管平滑肌收縮通路(vascular smooth muscle contraction pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)等。排名居前10位的通路見表2。通過通路氣泡圖對通路中的相關參數(shù)進行可視化分析，氣泡大小代表靶點數(shù)量，氣泡顏色由綠色至紅色代表P值由大到小，詳見圖4。

表2 KEGG富集分析居前10位的通路

圖4 KEGG通路氣泡圖

2.6 成分-靶點-通路分析 將成分、靶點及作用通路導入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡，詳見圖5。其中圓形代表入血成分，正方形代表交集靶點，三角形代表通路。形狀的大小根據(jù)度值大小進行排列，度值越大，形狀越大。利用Network Analyzer工具對網(wǎng)絡拓撲參數(shù)進行分析。結(jié)果顯示，馬錢苷連接度為21，介度為0.264 570，緊密度為0.465 839，為鹿角方治療慢性心力衰竭的主要有效成分，其次為寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、補骨脂素、異補骨脂素、莫諾苷，詳見表3。

圖5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖

表3 鹿角方主要成分網(wǎng)絡節(jié)點參數(shù)

3 討 論

慢性心力衰竭歸屬于中醫(yī)學“喘癥”“痰飲”“水腫”等范疇，病位在心，屬本虛標實之證。心為陽中陽臟，血脈運行全賴心中陽氣的推動。心陽的充足需腎陽不斷化生資助，心陽虛可損及腎陽，腎陽虛亦可損及心陽。因此，心腎陽虛貫穿慢性心力衰竭發(fā)展的始終。鹿角方是基于心力衰竭發(fā)病機制及心腎相關理論創(chuàng)制，由鹿角、補骨脂、淫羊藿、山茱萸、女貞子、沉香組方而成。方中鹿角、補骨脂、淫羊藿、山茱萸皆為溫補腎陽之品，以助心陽生發(fā)；女貞子滋補肝腎，寓以陰中求陽之意，加強本方的溫陽功效；沉香行氣止痛，為行氣理氣之佳品，使本方補而不滯，滋而不膩。諸藥合用，共奏補心腎之功效，從根本治療慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

相關研究表明，各種原因產(chǎn)生的能量減少與心力衰竭的發(fā)生密切相關[8]。胰島素抵抗通路與甲狀腺激素信號通路可調(diào)節(jié)心肌能量代謝，參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。甲狀腺素是一種必需激素，與生長、凋亡和能量代謝有關。有研究顯示，30歲以上的女性甲狀腺功能減退可增加10年心血管疾病風險[9]。動物實驗表明，甲狀腺素可激活AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)通路，促進線粒體復合體Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ激活，逆轉(zhuǎn)能量衰竭和線粒體腫脹，改善心臟功能障礙[10]。胰島素作為一種代謝激素，與心肌能量、結(jié)構(gòu)、功能和機體存活密切有關。胰島素抵抗病人因代謝途徑改變、能量代謝失衡、心肌收縮力受損等多種機制促進心力衰竭發(fā)生[11]。有研究表明，胰島素抵抗通路失調(diào)通過下游蛋白激酶B(AKT)和叉頭盒蛋白(FoxO)等信號通路，影響線粒體功能、心臟能量代謝和腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促進心力衰竭發(fā)生，血管平滑肌收縮通路與VEGF通路是調(diào)節(jié)血管舒張的重要通路[12]。有研究表明，血管張力和擴張是外周血容量的重要決定因素，可對心室前負荷和后負荷產(chǎn)生影響[13]。血管阻力增加、順應性降低是慢性心力衰竭病人的重要特征。因此，調(diào)節(jié)血管舒張在慢性心力衰竭治療中發(fā)揮著重要作用。除調(diào)節(jié)血管舒縮功能外，VEGF通路通過促進血管新生、抑制心肌細胞凋亡等，延緩心室重構(gòu)，抑制心力衰竭進展[14-15]。相關研究顯示，VEGF缺失的小鼠因循環(huán)系統(tǒng)紊亂進展為心力衰竭[16]。本研究結(jié)果顯示，鹿角方通過多靶點干預多條通路，協(xié)同干預慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的機制，延緩疾病進程。

目前，臨床藥物開發(fā)的主導模式是針對某一靶點設計最具選擇性的配體[17]。然而，單一靶點藥物常低于預期臨床療效，一方面由于人體是一個微妙的動態(tài)平衡體，另一方面基于任何一種疾病都不是單一靶點作用的結(jié)果。網(wǎng)絡生物學分析表明，疾病網(wǎng)絡一般不受單個節(jié)點的影響。針對復雜疾病，需要生物網(wǎng)絡中具有協(xié)同效應的組合節(jié)點，才能產(chǎn)生期望的治療效果[18]。慢性心力衰竭是一個多種病理機制的復雜疾病，目前臨床中常用藥物均是針對其中某一環(huán)節(jié)或靶點發(fā)揮作用，導致慢性心力衰竭只能在某一個指標得以改善，從而難以真正抑制心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學結(jié)果顯示，鹿角方通過多靶點、多通路、協(xié)同作用慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的多個機制，進而發(fā)揮協(xié)同治療作用。通過PPI網(wǎng)絡分析及富集分析明確了鹿角方治療慢性心力衰竭的可能機制，即通過胰島素抵抗、甲狀腺激素信號、血管平滑肌收縮、VEGF信號等通路，優(yōu)化能量代謝，調(diào)節(jié)血管舒張，提高心肌細胞的抗缺氧能力，保護受損心肌，進而抑制心力衰竭進程。本研究為鹿角方作用機制的研究提供方向。