張萌 劉旭明 麥皓塵 曾志芬

中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院1全科醫(yī)學(xué)科，2病理科（廣州 510000）

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，其中位生存期僅6～8個月，5年生存率僅7%～9%[1]，嚴重威脅著人類的健康。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)超過90%的胰腺癌患者存在 KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene）突變，但相關(guān)的靶向藥物研究進展緩慢，目前僅有一個針對KRAS G12C突變的小分子抑制劑處于臨床試驗階段，且觀察到其副作用較多[4]。溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是胱氨酸-谷氨酸運載體，其通過介導(dǎo)胱氨酸攝取促進谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷，在維持細胞內(nèi)外的氧化還原平衡中起重要作用[5]。已有研究[6]表 明KRAS突變腫瘤必須依靠SLC7A11攝取胱氨酸，由此推測KRAS突變的胰腺癌可能對SLC7A11抑制劑尤為敏感。柳氮磺吡啶是FDA批準的SLC7A11抑制劑[7]，臨床上已應(yīng)用于炎性腸病多年，副作用輕微可控。目前，KRAS測序越來越普及，但甚少有醫(yī)院或生物公司開展SLC7A11的表達檢測。本研究擬回顧性分析在中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院住院治療的54例胰腺癌患者的臨床資料，了解SLC7A11在KRAS突變胰腺癌中的陽性表達率，并探討其與胰腺癌分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病分期及預(yù)后的關(guān)系，這對于擬定SLC7A11治療的病例篩選標準、尋找胰腺癌的潛在治療靶點具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 入選病例標準及研究分組在中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院病歷系統(tǒng)檢索2019年1月1日至2021年12月31日入住該院、手術(shù)病理確診為胰腺癌、完善了KRAS基因測序且具備完整臨床資料及后續(xù)隨訪條件的54例患者（倫理批號：SYSEC-KY-KS-2021-186）。其中基因檢測提示KRAS突變27例、設(shè)為實驗組；無KRAS突變27例，設(shè)為對照組。排除標準：（1）同時合并其他腫瘤；（2）手術(shù)前曾接受其他抗腫瘤治療；（3）無法收集完整的臨床資料；（4）無條件進行后續(xù)隨訪。

1.2 臨床資料收集以下資料：（1）一般資料：性別、年齡、MR、CT、Pet-CT等影像學(xué)結(jié)果；（2）病理結(jié)果：腫物大小、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)。根據(jù)患者影像學(xué)資料和病理結(jié)果，評價胰腺癌分期標準（TNM分期【AJCC第八版】）[8]。（3）KRAS基因檢測結(jié)果；（4）分別在患者出院后6個月、1年、1.5年及2年電話隨訪，登記患者的生存狀況。

1.3 SLC7A11檢測

1.3.1 試劑兔抗xCT（SLC7A11，克隆號ab37185）多克隆抗體購于美國abcam公司，鼠抗ki67（MIB-1，克隆號ZM-0167）單克隆抗體、PV6000通用型免疫組化試劑盒（小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng)）、EDTA抗原修復(fù)液、封閉山羊血清購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 檢測方法胰腺癌組織標本經(jīng)過中性福爾馬林固定液固定、脫水、浸蠟、包埋制成目標組織蠟塊，以4 μm厚度切片；目標切片經(jīng)過脫水、脫蠟、抗原修復(fù)液、封閉等處理，滴加一抗孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片后閱片。

1.3.3 結(jié)果判讀SLC7A11染色陽性呈黃色或棕黃色，主要位于細胞漿和細胞膜，40倍物鏡下隨機選取5個視野進行觀察，根據(jù)腫瘤陽性率及染色強度進行綜合評分，評分標準：陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度分為無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞數(shù)與染色強度兩項得分相乘結(jié)果去均值為綜合評分，最后綜合評分＜3分為陰性，≥3分為陽性；以上由病理專業(yè)人員在雙盲法下進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法本研究涉及的所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。SLC7A11的表達和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗分析。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC7A11表達情況在KRAS陽性實驗組，SLC7A11陽性表達率為70.37%；在KRAS陰性對照組，SLC7A11陽性表達率為25.93%。KRAS陽性實驗組的SLC7A11陽性表達率顯著高于陰性對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），見表1。

表1 KRAS陰性對照組及陽性實驗組SLC7A11表達情況Tab.1 Expression of SLC7A11 in KRAS bright control group and positive experimental groups 例

2.2 胰腺癌患者臨床病理特征和SLC7A11的表達情況研究SLC7A11的陽性表達與患者年齡、性別、疾病分期、組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期各個因素的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SLC7A11的陽性表達與年齡（P=1.000）、性別（P=0.747）、腫瘤大?。≒=1.000）無關(guān)，與更晚的疾病分期（P＜0.001）、更差的組織學(xué)分級（P=0.003）、更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.038）、更短的生存期（P＜0.001）相關(guān)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 KRAS突變胰腺癌患者臨床病理特征和SLC7A11的表達情況Tab.2 Clinical characteristics of patients in pancreatic cancer with KRAS mutation samples and expression of SLC7A11 例

2.3 胰腺癌病理組織SLC7A11的表達結(jié)果A、B、C、D示SLC7A11在胰腺癌組織中腫瘤細胞的細胞漿和細胞膜呈陽性表達；E、F示SLC7A11在胰腺導(dǎo)管上皮和間質(zhì)細胞呈陰性表達。見圖1。

圖1 胰腺癌病理組織SLC7A11的表達Fig.1 SLC7A11 expression in pathological tissues of pancreatic cancer

3 討論

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，嚴重地威脅著人類的健康和生命。2019年美國因胰腺癌死亡人數(shù)達45 750例，成為美國第4大癌癥死因[9]。2020年全球胰腺癌新發(fā)病例逾49萬例、死亡病例逾46萬例。預(yù)計到2030年，胰腺癌將成為美國第2大癌癥死因[10]。在我國，特別是在某些大城市，胰腺癌的發(fā)病率已與西方國家持平，躍居全身惡性腫瘤第7位[11]。同時，胰腺癌起病隱匿，進展迅速，早診困難，80%左右的胰腺癌患者在診斷時已達局部晚期或者遠處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。近年來，針對多種惡性腫瘤的創(chuàng)新藥物（包括細胞免疫治療）取得了一系列令人鼓舞的成就，但在胰腺癌治療中卻罕見療效[12]。目前包括VEGF抑制劑貝伐珠單抗和多激酶抑制劑蘇尼替尼等在內(nèi)的靶向治療在胰腺癌中單藥或聯(lián)合吉西他濱均未能改善患者生存期，唯一在晚期胰腺癌治療中有統(tǒng)計學(xué)意義的靶向藥物厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱也只比單用吉西他濱組改善了不到2周的生存期[13]。因此，胰腺癌的治療除了手術(shù)、化療和放療等常規(guī)手段外，亟需尋求新的治療手段。

KRAS是人類最常見的致癌基因——RAS基因中最主要的成員，異常的KRAS蛋白對胰腺癌的生長和維持至關(guān)重要[2]。KRAS往往是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動基因，研究人員發(fā)現(xiàn)，在小鼠中突變的KRAS也能保持腫瘤的生長及幫助癌前腫瘤轉(zhuǎn)變成浸潤性腫瘤，關(guān)閉KRAS后，腫瘤消失了并且沒有復(fù)發(fā)的跡象[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，突變活化的KRAS在胰腺癌中可明顯促進轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達，進而激活下游的SLC7A11。2020年，一個針對KRAS突變、可有效抑制SLC7A11活性的小分子抑制劑HG106，被證實可阻斷SLC7A11/GSH代謝軸，從而抑制了肺腺癌的生長[16]。該研究證實，SLC7A11是突變KRAS的潛在協(xié)同致死基因，并提示抑制SLC7A11-GSH軸或可成為KRAS突變胰腺癌的新型治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)，在KRAS突變的胰腺癌患者中，70.37%存在SLC7A11陽性表達；而在KRAS陰性的患者中，僅有25.93%存在SLC7A11陽性表達，兩者的陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），這提示在KRAS突變較未發(fā)生該突變的患者中，SLC7A11的陽性表達幾率更高。

正常細胞通過消耗NADPH將胱氨酸還原為半胱氨酸來維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，而細胞的惡性增殖會導(dǎo)致NADH/NAD+升高，使細胞內(nèi)氧化還原失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[17]。有研究[18]表明，胰腺癌細胞高度依賴SLC7A11介導(dǎo)的胱氨酸攝取，以獲取半胱氨酸來維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，而高表達的SLC7A11可通過維持細胞內(nèi)高水平的GSH來抵消因細胞惡性增殖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，在胰腺癌的惡性增殖中發(fā)揮了重要的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在54例胰腺癌患者中，有48.15%的病例SLC7A11表達陽性，這與相關(guān)報道相符[20]。在年齡、性別、疾病分期、組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期多個研究因素中，SLC7A11的陽性表達與疾病分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期密切相關(guān)，和SLC7A11陰性表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明SLC7A11高表達患者具有更差的組織學(xué)分化和預(yù)后。

由于KRAS的作用范圍廣，且KRAS與RAS的其他兩個家族成員NRAS、HRAS同源，如果某種藥物能直接抑制KRAS，也就能抑制NRAS、HRAS的活性，推測這種藥物毒副作用較大。柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SSZ）為磺胺類抗菌藥，臨床上已廣泛用于潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，觀察副作用輕微可控。其作用機制主要是抑制NF-κB活性發(fā)揮抗炎作用，近年來還發(fā)現(xiàn)其可通過拮抗SLC7A11/xCT功能誘導(dǎo)癌細胞鐵死亡[21-22]以及其他多種途徑抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[23-24]。本研究提示，在發(fā)生KRAS突變的病例中，SLC7A11呈現(xiàn)更高的陽性表達率。因此，在檢測到KRAS基因突變的患者，應(yīng)積極完善SLC7A11的檢測；對于SLC7A11陽性表達的患者可嘗試SLC7A11抑制劑柳氮磺吡啶，這有望成為胰腺癌患者治療的新思路。

本研究存在的局限性：（1）入選病例數(shù)較少，其原因是基因檢測開展時間不長、且費用昂貴、未納入醫(yī)保；因此完成基因檢測的病例數(shù)不多；（2）未對其機制有深入研究。后續(xù)將繼續(xù)納入更多符合條件的病例、擴充樣本量，并建立動物或體外模型進行相關(guān)機制探索。