李紅艷，余先鋒，盛 燦，李瑜霞

0 引 言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種致殘、不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，加重社會和家庭的負擔[1-2]。糖尿病是AD危險因素，可能通過直接影響大腦中的β淀粉樣蛋白(Amyloid beta protein，Aβ)沉積來增加AD的患病風險[3-5]。因此探討糖尿病與AD之間的關(guān)系，有利于在危險因素層面防治AD。

目前關(guān)于AD的早期生物標記物眾多，如多模態(tài)磁共振成像、18F-florbetapir(AV45)正電子發(fā)射斷層成像(positron emission tomography, PET)[6]；然而尿阿爾茨海默相關(guān)神經(jīng)絲蛋白(urinary Alzheimer-associated neuronal thread protein，AD7c-NTP)由于其無創(chuàng)、無輻射、可重復(fù)測量、操作簡單、易于廣泛開展等特點，已經(jīng)成為一種具有良好應(yīng)用前景的AD外周生物標記物。AD和輕度認知障礙患者尿AD7c-NTP升高[7]；然而，目前對于其作為老年糖尿病患者認知障礙生物標志物的可行性尚未明確。本研究通過對比糖尿病伴有認知功能下降組(diabetes mellitus with cognitive decline group，DMCD)與認知功能正常組(normal control，NC)患者尿AD7c-NTP水平，探討尿AD7c-NTP升高與認知域下降的相關(guān)性，進一步明確尿AD7c-NTP在伴有認知功能下降的老年糖尿病患者中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2017年3月至2021年12月就診于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及記憶專科門診的110例糖尿病伴有認知功能下降患者(DMCD組)。其中2型糖尿病的診斷基于美國糖尿病協(xié)會制定的診斷標準：有糖尿病病史的患者，且空腹血糖升高(≥7.0 mmol/L或>126 mg/dL)[8]。排除標準：患有嚴重肝腎功能障礙、心功能衰竭，既往腦卒中病史，癲癇或癇性發(fā)作，嚴重的精神疾病，如精神分裂癥或嚴重抑郁，頭部外傷伴意識喪失病史者，酗酒或藥物濫用，帕金森病等。同期收集老年糖尿病認知功能正常者135例(NC組)，既往無認知障礙，無神經(jīng)、精神系統(tǒng)相關(guān)疾病病史。所有入組受試者均為右利手，漢族，并簽署知情同意書。臨床試驗注冊號為：ClinicalTrials.gov NCT03370744，臨床試驗注冊機構(gòu)為首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院。本研究已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會批準(批件號：臨研審[2017]046號)。

1.2研究方法所有受試者進行臨床資料的采集，全面的體格檢查及神經(jīng)心理測評包括簡易智能精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination，MMSE)、蒙特利爾認知評估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)、Rey聽覺詞語學習測驗(Auditory Verbal Learning Test，AVLT)、動物詞語流暢性(Animal Verbal Fluency Test，AVFT)、波士頓命名測驗(Boston Naming Test，BNT)、連線測驗A(Shape trails tests-A，STT-A)、連線測驗B(Shape trails tests-B，STT-B)等。

依據(jù)受教育程度及MoCA判定受試存在認知功能減退：MoCA分數(shù)在受教育年限0～6年的受試者MoCA<19分；受教育年限7～12年的受試者MoCA<22分；受教育年限≥13年受試者MoCA<24分[9]。

1.3尿AD7c-NTP的檢測所有受試者采集清晨清潔中段尿液樣本。按照參考文獻[10]進行離心后放入4°C冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗AD7c-NTP試劑盒(中國深圳安群生物科技有限公司)測定尿AD7c-NTP水平[10]。將100μL待測樣品加入相應(yīng)的孔中，設(shè)空白對照，在37 ℃下孵育1 h。用磷酸鹽緩沖鹽(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌5次。拍干后加入生物素化的兔抗AD7c-NTP抗體，孵育30 min，PBS洗滌5次。將樣品中加入辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白，孵育30min，PBS洗滌5次。依次加入50 μL顯色劑A和B，孵育15 min，PBS洗滌5次，拍干。最后，通過添加50μL硫酸作為停止緩沖液。使用450 nm波長的微孔板閱讀器(Multiskan Spectrum，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)測量每個樣品的光密度值。根據(jù)重組人AD7c-NTP肽的標準曲線，計算尿AD7c-NTP水平。

2 結(jié) 果

2.1 受試人口學資料和神經(jīng)心理學測評結(jié)果分析DMCD組和NC組患者性別、年齡、受教育程度差異均無統(tǒng)計學意義；而MMSE、MoCA、AVLT的長延遲回憶(AVLT-N5)及BNT的得分差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。DMCD組患者AVLT-N7、STT-A、STT-B及AVFT與NC組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

2.2受試血糖和尿AD7c-NTP水平對比兩組受試血糖比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DMCD組尿AD7c-NTP水平顯著高于NC組。見表1。

2.3尿AD7c-NTP水平與認知功能損害指標的相關(guān)性分析兩組受試尿AD7c-NTP水平與MoCA評分(r=-0.175)和波士頓命名評分(r=-0.172)呈負相關(guān)，但與AVLT-N5、AVLT-N7以及STT-A、STT-B、AVFT評分無關(guān)(P>0.05)。見表2，圖1。

表 1 所有受試者的人口學和臨床特征對比分析

表 2 尿AD7c-NTP水平與認知功能損害指標相關(guān)性

a:MoCA評分; b:波士頓命名評分

3 討 論

3.1認知功能下降的老年糖尿病患者尿AD7c-NTP水平升高AD7c-NTP在轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元細胞中過表達促進神經(jīng)元炎癥和細胞死亡，這兩個重要的神經(jīng)解剖學損傷與AD癡呆相關(guān)[11]。既往研究表明，AD7c-NTP免疫反應(yīng)性與神經(jīng)原纖維纏結(jié)和營養(yǎng)不良神經(jīng)突共定位，AD7c-NTP異常水平與tau免疫反應(yīng)性神經(jīng)原纖維纏結(jié)有關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在認知功能下降的老年糖尿病患者尿AD7c-NTP水平升高，與NC組比較存在顯著差異，這與本課題組既往的研究一致[12]。同時研究發(fā)現(xiàn)，認知功能下降患者血糖水平顯著高于對照組患者，這也間接驗證了血糖影響認知功能，血糖高者加重認知功能損傷。本課題組既往研究表明，在一般人群中，尿AD7c-NTP水平與糖化血紅蛋白(r=0.104)、胰島素(r=0.101)、三酰甘油(r=0.093)呈正相關(guān)[12]。對于存在AD危險因素(糖尿病、高三酰甘油血癥)受試者，尿AD7c-NTP水平略有升高，但未達到診斷認知功能障礙的臨界值。尿AD7c-NTP可作為預(yù)測AD風險的潛在的外周生物標記物[12]。

研究顯示，AD是一種與胰島素信號相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌疾病，被稱為是“第三類糖尿病”[13]。由于AD與胰島素信號通路受損有許多共同的特點，因此AD可被視為一種代謝性疾病。在某些情況下，如代謝異常，身體的糖尿病狀態(tài)可以通過影響葡萄糖向大腦的轉(zhuǎn)運和降低葡萄糖代謝來增加AD的發(fā)病率[13]。此外，由于糖尿病患者豐富的脂肪含量和高能量需求，大腦的代謝對線粒體提出了很大的要求。因此，大腦可能比身體其他部位更容易受到氧化損傷。最新證據(jù)表明，氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙都與Aβ病理學有關(guān)。未折疊蛋白反應(yīng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的蛋白變化可調(diào)節(jié)Aβ的產(chǎn)生，與tau蛋白的病理變化密切相關(guān)?？傊悄虿∫鸬拇x紊亂包括糖/脂代謝、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和蛋白質(zhì)變化與胰島素信號通路受損有關(guān)，這些代謝因子可能通過促進Aβ病理改變而增加糖尿病患者AD的患病率[3]。目前研究表明，2型糖尿病和高胰島素血癥可能通過對Aβ代謝和腦血管功能障礙的影響增加AD的風險[14]。即使是在糖尿病前期，空腹和餐后2h血糖水平與認知功能之間也存在線性關(guān)系[15]。研究表明，神經(jīng)絲蛋白(neuronal thread protein,NTP)的表達受胰島素和胰島素樣生長因子1刺激的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)[16]。研究表明，高血壓伴認知下降組尿AD7c-NTP水平顯著高于NC組，尿AD7c-NTP水平與MoCA評分和胰島素抵抗指數(shù)相關(guān)[17]。這些結(jié)果都與本研究結(jié)果一致。因此，重視危險因素的篩查和干預(yù)可作為AD的一級預(yù)防策略[18]。

3.2尿AD7cNTP水平與MoCA和波士頓命名評分呈負相關(guān)本研究顯示，尿AD7c-NTP的升高，與認知損害相關(guān)，認知損害越重，MoCA評分越低，尿AD7c-NTP水平越高。既往研究顯示，尿AD7c-NTP已經(jīng)被證實在AD癡呆期以及AD癡呆前的MCI期升高[7, 10]。尿AD7c-NTP的升高與認知功能下降有關(guān)；且尿AD7c-NTP水平與認知功能成負相關(guān)[19-20]。既往研究表明，尿AD7c-NTP在主觀認知下降階段未升高，其升高可能與更加嚴重的認知功能損害相關(guān)[20]。在認知正常人群中，尿AD7c-NTP水平與ApoE等級呈正相關(guān)，尿AD7c-NTP水平在存在AD風險因素的受試者中升高[21]。本研究進一步證實了這一觀點，尿AD7c-NTP的升高仍然是與認知功能的下降相關(guān)，認知功能下降的老年糖尿病患者應(yīng)積極做好預(yù)防，警惕進一步認知功能的惡化。

本研究還發(fā)現(xiàn)，波士頓命名的下降與尿AD7c-NTP水平呈負相關(guān)。波士頓命名是反映語言表達能力、命名能力的量表[22]。這提示老年糖尿病患者的認知功能損害是在語言表達和命名這一認知域分數(shù)越低，語言表達能力損害越大，尿AD7c-NTP水平越高，這一結(jié)果仍需大樣本進一步驗證。

本研究存在著不足與局限性。首先樣本量小，結(jié)果可能產(chǎn)生偏移；再者，本研究未能采集所有受試者的胰島素水平，由于數(shù)據(jù)不全，未進一步分析受試者的胰島素抵抗指數(shù)，今后我們將繼續(xù)完善相關(guān)數(shù)據(jù)資料，擴大樣本量，對患者進行動態(tài)隨訪觀察。

綜上所述，本研究提示認知功能下降的老年糖尿病患者尿AD7c-NTP水平升高，波士頓命名評分降低與尿AD7c-NTP水平呈負相關(guān)。