謝丹，黃盛文，吳江芬，張文儀，吳鵬，安邦權,4

(1.貴州大學醫(yī)學院，貴陽 550025；2.貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，貴陽 550002；3.遵義醫(yī)學院，貴州遵義 564699；4.貴州省人民醫(yī)院紀檢監(jiān)察室，貴陽 550002)

Melnick-Needles綜合征(Melnick-Needles syndrome，MNS)又稱骨結構不良綜合征，是臨床表型重疊的5種X連鎖疾病中的一種，其余4種依次為耳腭指綜合征Ⅰ型、耳腭指綜合征Ⅱ型、額骨干骺端結構不良和終端骨發(fā)育不良，這些統(tǒng)稱為耳腭指疾病譜(otopalatodigital syndrome spectrum disorders，OPDSD)[1-4]。迄今為止，全世界報道的MNS病例不到70例[4-5]?；加羞@種疾病的多數(shù)是女性，具有典型的特征性面容：眼球突出、臉頰豐滿、小頜畸形，并伴有身材矮小、骨骼異常等[6]。因MNS極其罕見，且有些病例是致命的，大多數(shù)情況下，在家族中檢測出來即為新發(fā)疾病，其以X連鎖顯性方式遺傳[7-8]。本研究用全外顯子測序和Sanger測序技術對1例臨床疑似MNS患者進行臨床表型和基因變異分析，明確其可能的致病原因，為患者提供適當?shù)漠a(chǎn)前篩查策略和遺傳咨詢。

1 對象與方法

1.1研究對象 先證者，女，21歲，2021年3月于貴州省人民醫(yī)院就診。先證者1歲時開始出現(xiàn)胸廓發(fā)育異常，呈雞胸和漏斗胸。8歲時出現(xiàn)脊柱后凸，雙眼突出，生長發(fā)育遲緩，身材矮小，無智力障礙。近5年反復出現(xiàn)心悸、胸悶、咳嗽、咳痰、呼吸困難。查體：身高130 cm，體重25 kg；特殊面容：雙眼突出，眼距增寬，上唇較厚，下巴短?。患怪笸?，胸廓畸形；手指和腳趾細長，末端粗大，呈爪型手。見圖1。CT檢查提示：雞胸合并漏斗胸，雙肺灌注異常。DR檢查提示：頸椎生理曲度變直，脊柱胸段后突。心臟彩超檢查提示：右房、右室增大，二尖瓣局限性返流，二尖瓣前瓣尖稍脫垂，微量反流。家族中無類似患者。

注：A、B，手指和腳趾細長，末端粗大；C，特殊面容，上唇較厚，下巴短小。圖1 患者手腳部表現(xiàn)及特殊面容

1.2主要儀器與試劑 Nanodrop one超微量分光光度儀(美國賽默飛世爾公司)；NovaSeq 6000基因測序儀(美國Illumina公司)；ABI3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)； QIAamp DNA blood Mini kit(德國QIAGEN公司)。

1.3標本采集與處理 在征得先證者和家屬的知情同意后，收集先證者及其父母的外周靜脈血標本，用QIAamp DNA blood Mini kit 提取先證者及其父母全基因組DNA(操作按照試劑盒說明書進行)，DNA 純度和濃度用Nanodrop one超微量分光光度儀檢測，DNA樣品于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯糠桨斧@得貴州省人民醫(yī)院倫理學委員會批準[批準文號：倫審(科研)2022-05號]。

1.4全外顯子組測序 將先證者及其父母DNA樣品送至北京貝瑞和康醫(yī)學檢驗實驗室有限公司進行全外顯子組高通量測序。首先從200 μL外周血中提取1 μg基因組DNA。50 ng DNA被裂解酶打斷至200 bp左右。然后對DNA片段進行末端修復，并在3′端添加一個A堿基。用接頭連接DNA片段，用XP微珠收集到約320 bp的片段。PCR擴增后，根據(jù)NanoWES說明書的步驟雜交并捕獲DNA片段。對雜交產(chǎn)物進行洗脫和收集后進行PCR擴增和純化。最后，用NovaSeq 6000 基因測序儀，采用150 bp的雙端測序模式對該家族的基因組DNA進行測序。用Burrow-Wheeler比對工具將測序讀數(shù)與人類參考基因組(HG19/GRCh37)進行比對。利用Verita Trekker?變異位點檢測系統(tǒng)和Enliven?變異位點注釋解讀系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析。注釋數(shù)據(jù)庫主要包括： gnomAD(http://gnomad.broadinstitute.org/)，人群千人基因組(http://browser.1000genomes.org)， OMIM(http://www.omim.org)，ClinVar(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinv.ar)，HGMD(http://www.hgmd.org)，HPO(https://hpo.jax.org/app/)等。

1.5Sanger測序 根據(jù)GenBank (NM_001110556.2)中的參考序列設計PCR引物(F：GTGGTTCCCTGCT

TTGACG；R：CCGCCGTACTTGATGGTGA)。PCR反應體系為25 μL，包括 12.5 μL mix，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用PCR法進行擴增，以PCR擴增產(chǎn)物進行一代測序驗證。用ABI3730xl測序儀進行Sanger測序，測序結果使用“Mutation Surveyor”軟件與參考序列進行比對分析。

1.6生物信息學分析 HomoloGene系統(tǒng)分析錯義變異的氨基酸位點是否具有跨種屬保守性；根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)遺傳變異分類標準與指南分析變異位點的致病性[9]。

2 結果

2.1全外顯子組測序 先證者樣本檢測到FLNA基因的1個變異：NM_001110556.2: c.3562G>A(p.A1188T)，導致FLNA蛋白第1 188位的丙氨酸替換為蘇氨酸。判讀為致病，與X連鎖顯性遺傳疾病Melnick-Needles綜合征(OMIM:309350)相關。

2.2Sanger測序驗證 先證者在FLNA基因上發(fā)生c.3562G>A雜合突變，父親和母親均未攜帶該變異(圖2)，因此為新發(fā)變異。

注：A，先證者FLNA基因的c.3562G>A變異；B，先證者父親該位點為野生純合型；C，先證者母親該位點為野生純合型。圖2 Sanger測序結果

2.3變異位點致病性分析FLNA基因第22外顯子存在c.3562G>A錯義變異，根據(jù)Sanger測序結果，該變異只有先證者檢出，父親和母親均未發(fā)生突變，故屬于新發(fā)變異(PS2)；參考gnomAD、人群千人基因組(1000G)等數(shù)據(jù)庫，未見該變異的收錄(PM2)。

根據(jù)文獻報道,共在多例(6～14例)Melnick-Needles綜合征疾病先證者中檢出該變異[PMID:12612583;29575627] (PS4_Moderate); 經(jīng)統(tǒng)計方法(REVEL)預測，結果顯示該變異對基因或基因產(chǎn)物造成有害影響(PP3); 此外，該基因錯義變異是造成相關疾病表型的常見機制，且良性錯義變異比例低(PP2)。根據(jù)ACMG指南，該變異的證據(jù)為PS2、PM2、PS4_Moderate、PP3、PP2，故歸類為致病性變異。

2.4生物信息學分析 經(jīng)HomoGene和T-coffee系統(tǒng)對人、獼猴、家犬、牛、鼠、原雞6個物種的FLNA基因氨基酸序列進行同源性多重比對，結果表明第1 188位丙氨酸(Ala)均高度保守(圖3)。

圖3 不同物種之間保守性分析

3 討論

Melnick-Needles綜合征是一種遺傳性骨骼發(fā)育不良疾病[10]。1966年， Melnick和Needles首次描述了一些家庭成員患有嚴重的先天性骨骼疾病，這些疾病表現(xiàn)出典型的面部特征，如眼球突出、面頰飽滿、小頜畸形，并伴有下肢S形彎曲、肋骨不規(guī)則收縮、顱底硬化[3]。本例先證者有部分表型符合以上描述，此外，還累及心臟、輸尿管和肺部，雖然MNS的發(fā)病機制尚未確定，但泌尿系統(tǒng)、肺部和心臟受累在MNS先證者中也很常見[11-12]。

Robertson等[13]于2003年報道該綜合征由編碼細絲蛋白A(filamin A)的FLNA基因突變引起，此突變導致蛋白質的功能缺陷。FLNA是1個X連鎖基因，位于Xq28，由48個外顯子組成，其編碼的蛋白質是一種廣泛表達的蛋白質，通過與整合素、跨膜受體復合物和第二信使相互作用調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的重組，在膜穩(wěn)定性、交聯(lián)F-肌動蛋白結合其他與細胞信號和細胞骨架完整性整合功能一致的蛋白質方面具有重要作用，該基因的缺陷是導致多種綜合征的原因[14-17]。

MNS先證者表現(xiàn)出不同的表型，例如，Sheen等[18]報道了單卵雙胞胎姐妹，但其中只有1個患MNS；又如Oh等[4]報道的病例中，盡管家族女性成員的表型嚴重程度不同，但她們都有相同的FLNA基因突變(c.3578 T>C，p.L1193P)。此外，對于男性來說表型的嚴重程度取決于母親，未受影響母親所生的男性表現(xiàn)出與女性相似的表型，受影響母親所生的男性通常具有更為嚴重表型，表現(xiàn)為突眼、角膜硬化、高血壓、嚴重的小頜畸形、腭裂、臍膨出、腎發(fā)育不良、梗阻性泌尿系統(tǒng)畸形、手腳畸形、頸胸前凸、不規(guī)則肋骨、長骨彎曲以及拇指發(fā)育不全或缺失[1,7]。因此， MNS先證者的表型以身材矮小和骨骼發(fā)育不良為主，可能因環(huán)境和遺傳因素而略有不同。除此之外，如上所述，男性和女性的表型也因母親是否受MNS影響而呈明顯差異。

在臨床診斷中，與MNS表型重疊的疾病除了耳腭指譜系疾病之外，還有粘多糖貯積癥(mucopolysaccharidosis，MPS)，其是一種因蛋白聚糖降解酶先天性缺陷所引起的蛋白聚糖分解代謝障礙性疾病；由于溶酶體內酶活性下降或者缺乏，機體分解粘多糖障礙，導致這些粘多糖分子在細胞內、血液和結締組織中沉積，從而產(chǎn)生相應的臨床癥狀，可分為MPSⅠ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅵ型、Ⅶ型、Ⅺ型和數(shù)種亞型[19]。在鑒別診斷中，MNS與MPS較顯著的區(qū)別是MPSⅠ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型和Ⅺ型表現(xiàn)出不同程度的智能落后，而Ⅳ型、Ⅵ型雖智力正常，但存在角膜混濁這一較典型的特征。本例先證者就曾誤診為MPSⅥ型。由于臨床表現(xiàn)的多樣性，在不同患者中還應根據(jù)實際情況進行分析鑒別。

目前國外已報道數(shù)十例MNS患者，國內也可見相關綜合征的報道。本例先證者檢出FLNA基因c.3562G>A錯義變異，使得FLNA基因編碼的蛋白第1 188位氨基酸由丙氨酸變異為蘇氨酸(p.A1188T)，從而導致多肽產(chǎn)物的氨基酸序列改變。文獻報道的病例中FLNA基因的變異主要聚集在特定區(qū)域，如發(fā)生在外顯子3～5、22、28～33和43～45[16]。而本例先證者變異位于第22外顯子，是MNS變異的主要聚集區(qū)域。Sanger測序驗證結果顯示先證者攜帶的FLNA基因變異為新發(fā)，再發(fā)風險低，但不排除其親代之一為生殖腺嵌合的可能。

綜上所述，通過外顯子組測序確診了1例Melnick-Needles綜合征患者。該病例豐富了MNS基因變異與臨床表型譜，結合基因檢測為MNS的分子診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)。