王 勛，李 鴿，李青梅，呂镕州，孟澤錕，柴書軍，楊繼飛，郭軍慶，張改平，4

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4. 揚(yáng)州大學(xué) 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

禽流感病毒（Influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒屬（Influenza virus genus），部分亞型可引起人畜共患病[1-3]。2013 年，我國(guó)首次在上海和安徽出現(xiàn)人感染H7N9 的病例，2016-2017 年的第五波大流行中感染病例數(shù)最多，在一些H7N9 亞型禽流感病毒中檢測(cè)到突變，這標(biāo)志著一種新的高致病性禽流感病毒（HPAIV）出現(xiàn)[4-6]，導(dǎo)致家禽發(fā)病率和死亡率增加，這種高致病性H7N9 病毒嚴(yán)重威脅著公眾健康[7]。在我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2020 年7 月發(fā)布的第314 號(hào)公告中，制定了4 種禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗的產(chǎn)品制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等。此次的疫苗更新主要是針對(duì)H7 亞型毒株的變異，由H7-Re2 抗原株變更為H7-Re3 抗原株，毒株的更新代表著禽流感病毒的快速變異[8-10]。流感病毒為單股負(fù)鏈RNA 病毒，編碼8個(gè)不同的基因，以HA基因和NA基因的變異最為顯著，由點(diǎn)突變引起的抗原漂移和不同毒株之間的基因重組引起的抗原轉(zhuǎn)變是流感病毒實(shí)現(xiàn)快速變異的主要機(jī)制[11]。因此，病毒的快速、高度變異對(duì)流感的防控帶來了挑戰(zhàn)。

面對(duì)快速變異的H7N9 亞型禽流感病毒，快速檢測(cè)技術(shù)也需要隨之更新，以便對(duì)新變異的病毒實(shí)現(xiàn)快速識(shí)別并清除。單克隆抗體具有結(jié)構(gòu)均一、特異性強(qiáng)、純度高、效價(jià)高和交叉反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，被用于疫苗的生產(chǎn)、抗原的純化和免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究，在病原檢測(cè)和疾病診斷防治等方面也發(fā)揮了重要作用[12-16]。前期研制基于HA 蛋白單克隆抗體的H7亞型AIV 膠體金快速檢測(cè)試紙可以實(shí)現(xiàn)對(duì)H7-Re2抗原株的檢測(cè)，但無法檢測(cè)到H7-Re3 抗原株[12]。而H7-Re3 變異株的出現(xiàn)使現(xiàn)有的基于單克隆抗體的抗原膠體金快速檢測(cè)方法受限，因此，制備出廣譜性識(shí)別H7N9 亞型禽流感病毒HA 蛋白的單克隆抗體迫在眉睫。鑒于此，將采用差速離心法純化的H7N9（A/Chicken/Guangdong/SW154/2015）毒株雞胚尿囊液作為免疫原免疫BALB/c小鼠，通過基于H7-Re3 變異株的血凝抑制試驗(yàn)（HI）、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）和間接ELISA 方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，以期制備并鑒定特異性強(qiáng)、效價(jià)高和穩(wěn)定性好的廣譜性識(shí)別H7N9 亞型AIV HA 蛋白的單克隆抗體，旨在為H7 亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物、細(xì)胞系和毒株

SPF 級(jí)6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司；SPF 級(jí)雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；所有H7N9 病毒試驗(yàn)均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全三級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；犬腎細(xì)胞（MDCK）和小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；所有H7N9毒株均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；雞新城疫病毒（NDV）由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；H7-Re2 和H7-Re3 抗原株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

HAT、HT 和融合劑PEG 1500 均購(gòu)自Sigma 公司；HA 重組蛋白A/Anhui/1/2013（H7N9）購(gòu)自Sino Biological 公司；小鼠陽(yáng)性血清和陰性血清均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；弗氏佐劑、羊抗雞酶標(biāo)二抗和羊抗鼠酶標(biāo)二抗購(gòu)自Jackson公司；鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)自Proteintech Group 公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DMEM培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.3 H7N9亞型AIV的增殖和純化

將 H7N9 亞 型 AIV（A/Chicken/Guangdong/SW154/2015）用無菌PBS 1∶1 000稀釋，取0.1 mL接種于9～11 日齡SPF 雞胚尿囊腔，在37 ℃孵化箱培養(yǎng)24～72 h，無菌收取尿囊液后，通過血凝（HA）試驗(yàn)測(cè)定其HA 效價(jià)，同時(shí)應(yīng)用Reed-Muench 方法測(cè)定病毒尿囊液對(duì)MDCK 細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50）。將收集得到的病毒尿囊液用β-丙內(nèi)酯滅活后采取差速離心法純化，純化后的病毒用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，分裝后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)物免疫

隨機(jī)選取5 只6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量為50 μg/只。首次免疫將H7N9 純化病毒與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射。在首次免疫后的第14、28天用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，采用與首免相同的方式對(duì)小鼠進(jìn)行二免和三免。采用ELISA 方法對(duì)免疫小鼠血清的抗體滴度進(jìn)行評(píng)估，選取效價(jià)最高的小鼠直接腹腔注射100μg的H7N9純化病毒進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在3 d 后對(duì)加強(qiáng)免疫的小鼠進(jìn)行采血，留血清作為陽(yáng)性血清備用，并進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.5 細(xì)胞融合和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

無菌取出小鼠脾臟，研磨分離成單個(gè)脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。用HAT培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)7～10 d，取細(xì)胞上清，采用HI、IPMA 和間接ELISA 方法篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性孔細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，建立穩(wěn)定分泌抗H7N9 AIV HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.6 腹水制備

以體內(nèi)誘生腹水法制備抗H7N9 AIV 單克隆抗體，將（2～5）×106個(gè)細(xì)胞經(jīng)腹腔注射弗氏不完全佐劑致敏的BALB/c 經(jīng)產(chǎn)母鼠，7～10 d 后抽取小鼠腹水，通過HI試驗(yàn)和ELISA方法測(cè)定腹水的抗體效價(jià)。

1.7 單克隆抗體鑒定

1.7.1 HA 和HI 試 驗(yàn) 用PBS 將H7-Re3 抗原 株進(jìn)行2 倍梯度稀釋，加入96 孔V 形微量反應(yīng)板中（50μL/孔），每孔加入等量0.5%雞紅細(xì)胞，室溫靜置30 min 后測(cè)定其HA 效價(jià)。將收集到的雜交瘤細(xì)胞上清原液，與4 個(gè)HA 單位的H7-Re3 抗原株混合。將抗體-病毒混合物在室溫下孵育30 min 后與0.5%雞紅細(xì)胞混合。室溫孵育30 min，觀察紅細(xì)胞凝集，以100%抑制凝集的最大稀釋度為腹水HI效價(jià)。

1.7.2 間接ELISA 將HA 重組蛋白A/Anhui/1/2013（H7N9）用碳酸鹽緩沖液（CBS）稀釋至1μg/mL后，包被至96 孔板中（50 μL/孔），37 ℃靜置孵育2 h，用PBST 洗5 遍；用含5%脫脂奶粉的封閉液于37 ℃靜置封閉1 h，用PBST 洗5 遍；加入50μL 雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃靜置孵育30 min，用PBST洗5遍；加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ℃靜置孵育30 min 后，用PBST 洗5 遍；加入單組分TMB 顯色液，室溫顯色10 min；加入終止液終止顯色，用酶標(biāo)儀讀取每孔的OD450nm。

1.7.3 IPMA 試驗(yàn) 在96 孔細(xì)胞板中培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞 至 密 度 為70%～90%，接 種H7N9（A/Chicken/Guangdong/SW154/2015）毒株，感染24 h 后棄培養(yǎng)上清，每孔加入預(yù)冷的無水乙醇室溫固定10～15 min，用PBST 洗5遍；用含5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃靜置封閉1 h，用PBST 洗5 遍；加入待檢抗體37 ℃靜置孵育1 h，用PBST洗5遍；加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗37 ℃靜置孵育1 h，用PBST洗5遍；加入AEC顯色液室溫顯色10 min，在顯微鏡下觀察顯色情況。

1.7.4 亞型鑒定 用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)收集的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行亞型鑒定，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.7.5 IPMA 鑒定單克隆抗體特異性 按照1.7.3中的IPMA 方法檢測(cè)單克隆抗體與H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 和H9N2 亞型流感病毒的反應(yīng)性。在培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞的96 孔板中分別接種不同亞型毒株（表1），通過顯色情況判斷抗體反應(yīng)的特異性。

表1 不同亞型流感病毒Tab.1 Different subtypes of influenza virus

1.7.6 廣譜性鑒定 將不同株的H7亞型AIV（表2）感染MDCK 細(xì)胞，用IPMA 方法檢測(cè)單克隆抗體與不同年份分離出來的H7亞型AIV的廣譜反應(yīng)性。

表2 不同年份分離的H7N9亞型流感病毒Tab.2 H7N9 subtype influenza virus isolated in different years

1.7.7 中和活性鑒定 按照1.7.3 中IPMA 方法，將單克隆抗體上清（以小鼠陽(yáng)性血清為陽(yáng)性對(duì)照，1 640 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照）與100 TCID50H7N9 AIV混合，37 ℃反應(yīng)1 h 后將病毒-抗體復(fù)合物感染MDCK 細(xì)胞，感染24 h 后，加入雞H7N9 陽(yáng)性血清（1∶500 稀釋）作為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗雞抗體作為二抗；加入AEC 顯色液室溫顯色10 min，在顯微鏡下觀察顯色，檢測(cè)單克隆抗體的中和活性。

1.7.8 與H7-Re2 和H7-Re3 反應(yīng)性鑒定 用Dot blot 鑒定抗體與H7-Re2 和H7-Re3 反應(yīng)性，具體操作：將H7-Re2、H7-Re3 抗原株和雞新城疫病毒（NDV）依次各取2 μL，點(diǎn)印在6 張硝酸纖維素膜（NC）上；用含5%脫脂奶粉的封閉液在37 ℃恒溫箱靜置封閉2 h，用PBST 洗5 遍；分別加入5 株雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗37 ℃反應(yīng)30 min，用PBST 洗5遍；加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育30 min，用PBST洗5遍后，用ECL顯影液進(jìn)行結(jié)果鑒定。

1.7.9 Western blot 檢測(cè) 將HA 重組蛋白A/Anhui/1/2013（H7N9）和SDS-PAGE 上樣緩沖液混合，煮沸15 min，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液在37 ℃恒溫箱靜置封閉2 h，分別以5 株雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，用羊抗鼠酶標(biāo)二抗孵育后進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 H7N9亞型AIV的純化結(jié)果

經(jīng)Reed-Muench 法測(cè)定A/Chicken/Guangdong/SW154/2015毒株的TCID50為10-5.9/0.1 mL，雞胚尿囊液的HA 效價(jià)為8 log2，經(jīng)差速離心法純化得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為8 mg/mL。

2.2 抗H7N9 AIV HA蛋白雜交瘤細(xì)胞株篩選

采用有限稀釋法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行3次連續(xù)亞克隆，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，通過HI、IPMA 和ELISA方法篩選獲得了能穩(wěn)定分泌抗體的5個(gè)雜交瘤細(xì)胞株。IPMA 單克隆抗體檢測(cè)方法的結(jié)果如圖1所示，5 株雜交瘤細(xì)胞上清（圖1A—1E）和小鼠陽(yáng)性血清（圖1F）能夠檢測(cè)到在H7N9 AIV 感染的MDCK 細(xì)胞中與病毒特異性結(jié)合，結(jié)果呈陽(yáng)性。小鼠陰性血清不與H7N9 AIV 感染的MDCK 細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果呈陰性（圖1G）。

圖1 抗H7N9 AIV HA蛋白雜交瘤細(xì)胞株的IPMA檢測(cè)結(jié)果Fig.1 IPMA detection results of anti-H7N9 AIV HA protein hybridoma cell lines

2.3 抗H7N9 AIV HA蛋白單克隆抗體特性鑒定

2.3.1 間接ELSIA效價(jià)測(cè)定 通過間接ELISA測(cè)得5株雜交瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價(jià)均為1∶1 000 000（表3）。

2.3.2 亞型鑒定 通過鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定結(jié)果顯示，4株單克隆抗體的重鏈為IgG1，1 株單克隆抗體的重鏈為IgG2b，5 株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈（表3）。

2.3.3 HI 效價(jià)測(cè)定 通過HI 試驗(yàn)測(cè)得5 株雜交瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水針對(duì)H7-Re3 抗原株的HI效價(jià)均在7 log2～12 log2（表3）。

表3 單克隆抗體特性鑒定Tab.3 Monoclonal antibody characterization

2.3.4 特異性鑒定 IPMA 檢測(cè)結(jié)果顯示，5 株單克隆抗體只與H7 亞型AIV 發(fā)生反應(yīng)，與表1 所示的H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亞型AIV不反應(yīng)（圖2），具有較好的特異性。

圖2 抗H7N9 AIV HA蛋白單克隆抗體特異性鑒定Fig.2 Specific identification of anti-H7N9 AIV HA protein mAbs

2.3.5 中和活性鑒定 通過IPMA 方法對(duì)5 株雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行中和活性的測(cè)定，結(jié)果顯示，檢測(cè)孔（圖3A—E）中感染細(xì)胞數(shù)小于陰性對(duì)照孔（圖3G），證明5 株抗H7N9 AIV HA 蛋白單克隆抗體均具有中和活性。

圖3 抗H7N9 AIV HA蛋白單克隆抗體中和活性鑒定Fig.3 Identification of neutralizing activity of anti-H7N9 AIV HA protein mAbs

2.3.6 廣譜性鑒定 不同年份的H7 亞型AIV 感染MDCK 細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示，5 株單克隆抗體均可以與不同株的病毒發(fā)生反應(yīng)（圖4），表明篩選的單克隆抗體具有廣譜反應(yīng)性。

圖4 抗H7N9 AIV HA蛋白單克隆抗體廣譜性鑒定Fig.4 Broad-spectrum identification of anti-H7N9 AIV HA protein mAbs

2.3.7 與H7-Re2、H7-Re3 抗原株反應(yīng)性鑒定 Dot blot 鑒定了5 株單克隆抗體與H7-Re2 和H7-Re3 抗原株的反應(yīng)性，鑒定結(jié)果顯示，5株抗體不僅識(shí)別變異株H7-Re3，也可識(shí)別H7-Re2抗原株（圖5）。

圖5 單克隆抗體與H7-Re2、H7-Re3抗原株的反應(yīng)性鑒定Fig.5 Identification of the reactivity of mAbs with H7-Re2 and H7-Re3 antigenic strains

2.3.8 Western blot 鑒定 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，制備的5 株單克隆抗體均在約63 ku 處出現(xiàn)1 條特異性的條帶（圖6），說明制備的5 株單克隆抗體與HA 重組蛋白A/Anhui/1/2013（H7N9）具有較好的反應(yīng)性，識(shí)別的是線性表位。

圖6 抗H7N9 AIV HA蛋白單克隆抗體的Western blot鑒定Fig.6 Western blot identification of anti-H7N9 AIV HA protein mAbs

3 結(jié)論與討論

由于流感病毒的多宿主性和高度變異性，使得現(xiàn)有的流感檢測(cè)和診斷技術(shù)的有效性受到限制[17-19]。因此，研制廣譜性識(shí)別流感病毒的單克隆抗體和檢測(cè)試劑對(duì)流感病毒的監(jiān)測(cè)與防控具有重要意義。本研究采用全病毒免疫小鼠的方法，改變單克隆抗體篩選方式，將2019 年后出現(xiàn)的H7-Re3變異株直接作為HI 試驗(yàn)的抗原檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株的上清，并且結(jié)合基于全病毒的IPMA 試驗(yàn)和基于HA 蛋白的ELISA 篩選方法，篩選到可識(shí)別H7-Re2變異株和H7-Re3 變異株且具有較好中和活性的單克隆抗體。

HA 蛋白是流感病毒的主要表面抗原，感染宿主后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。HA 蛋白的主要功能是與細(xì)胞表面受體結(jié)合以及介導(dǎo)膜融合，還可能在病毒粒子出芽和形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮作用。流感病毒的快速變異使得現(xiàn)用疫苗的毒株持續(xù)更新，篩選到靶向HA 蛋白的中和抗體以及后續(xù)保守表位的研究可以為新型通用疫苗的設(shè)計(jì)提供思路。本研究篩選的5株具有廣譜反應(yīng)性的單克隆抗體不僅可以識(shí)別H7-Re2 抗原株，為2019 年以前的H7 亞型AIV 提供檢測(cè)的技術(shù)手段，還可以與H7-Re3 抗原株發(fā)生反應(yīng)，因此也可以檢測(cè)到2019年以后發(fā)生變異的H7 亞型AIV，對(duì)目前H7 亞型AIV 的檢測(cè)和監(jiān)控具有重要意義。SUN 等[20]研制了一種基于2 株中和單克隆抗體的H7N9 特異型膠體金快速檢測(cè)試紙，該試紙可以檢測(cè)拭子和肺部樣本，實(shí)現(xiàn)對(duì)H7N9 AIV 的快速檢測(cè)。同樣，YANG 等[21]建立了一種基于2 株HA 蛋白單克隆抗體的ELISA 方法檢測(cè)H7N9 AIV，對(duì)HA 蛋白的檢出限為3.9 ng/mL，也可以檢測(cè)到H7N9 AIV，為H7N9 的檢測(cè)提供技術(shù)支持。對(duì)于快速變異的流感病毒，基于單克隆抗體的膠體金快速檢測(cè)試紙和ELISA 方法需要及時(shí)更新，本研究篩選的5株具有中和活性的單克隆抗體均可識(shí)別2019年前后的H7亞型AIV，后續(xù)可以這5株單克隆抗體為基礎(chǔ)，建立快速檢測(cè)技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)H7亞型AIV的持續(xù)監(jiān)測(cè)。

本研究采用雜交瘤技術(shù)成功制備5株具有較高特異性的單克隆抗體，具有較好廣譜性，可以識(shí)別H7-Re2 抗原株和H7-Re3 變異株，為H7 亞型禽流感病毒快速檢測(cè)方法的建立提供了技術(shù)支持。此外，5株靶向HA蛋白的單克隆抗體還具有較好的中和活性，為后續(xù)中和表位的研究提供參考。