姬俊華，楊瑞先，劉 萍，王奧一，李靜宜，孫高峰，何艷紅，杜 凡

（洛陽(yáng)理工學(xué)院 環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

牡 丹（Paeonia suffruticosa）屬 芍 藥 科（Paeoniaceae）芍 藥 屬（Paeonia）牡 丹 組（Sect.Moutan）多年生落葉灌木，是我國(guó)傳統(tǒng)名花，兼具觀賞和藥用價(jià)值[1]。近年來(lái)，連作導(dǎo)致牡丹種植區(qū)土傳病害發(fā)病日益嚴(yán)重，一定程度上制約了牡丹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，牡丹根腐病（又稱(chēng)爛根?。┦堑湫偷耐羵鞑『?，在牡丹的整個(gè)生育期均可造成危害。在牡丹主要種植區(qū)，根腐病發(fā)病率一般為20%，嚴(yán)重地塊可達(dá)40%以上，影響牡丹觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，制約牡丹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[2]。前人對(duì)牡丹根腐病的研究主要集中在病原菌的分離及防治[3-4]方面，認(rèn)為引起根腐病的病原菌種類(lèi)主要為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），同 時(shí) 認(rèn) 為，尖 孢 鐮 刀 菌（F.oxysporum）和絲核菌屬（Rhizoctoniasp.）、腐霉屬（Pythiumsp.）、擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）真菌作為常見(jiàn)土壤習(xí)居菌，在根腐病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，往往與腐皮鐮刀菌混合侵染，加重根腐病的發(fā)生[5]。這表明牡丹根腐病的發(fā)生與根際其他腐生菌也密切相關(guān)。

目前，植物健康狀況與其根際或根部微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。植物病害的發(fā)生與植物根際、根面和根內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)的改變存在一定的相關(guān)性，尤其是隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，研究者已能從微生物群落水平分析影響植物病害發(fā)生的主要微生物種類(lèi)。例如，WU等[6]通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Ρ妊芯咳呓】抵仓昙案≈仓旮鶅?nèi)微生物發(fā)現(xiàn)，健康與患病植株根內(nèi)細(xì)菌和真菌種群組成不同，患病植株根部組織中假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌和土赤殼菌屬（Ilyonectria）真菌豐度顯著高于健康植株，表明三七根腐病的發(fā)生與根內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。ZHANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，感染柑橘黃龍病植株樣本和健康植株樣本中根面細(xì)菌種群豐度不同，且細(xì)菌功能基因表達(dá)水平不同，其中，慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）和伯克霍爾德菌（Burkholderia）在病株根面顯著富集，而土壤桿菌（Agrobacterium）和假單胞菌的相對(duì)豐度較健株根系明顯降低。

牡丹根腐病作為一種土傳病害，其發(fā)生與根部組織微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系目前尚無(wú)相關(guān)研究。探究牡丹健株和根腐病病株微生物群落結(jié)構(gòu)差異等，能夠揭示根腐病發(fā)生與根部組織微生物群落之間的關(guān)系，也可為進(jìn)一步獲取對(duì)牡丹根腐病有抑制作用的有益微生物提供新資源?；诖耍瑪M以牡丹健株和根腐病病株根部組織為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析牡丹根部組織中細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以探究牡丹健株與根腐病病株根部組織中細(xì)菌與真菌的種群結(jié)構(gòu)組成及差異，揭示根腐病發(fā)生與微生物群落結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，為生防菌篩選和利用微生態(tài)手段防控牡丹根腐病的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)，促進(jìn)牡丹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 樣本采集與處理

健株和根腐病病株根部組織樣本于2018 年3月采集自河南省洛陽(yáng)市隋唐城遺址植物公園牡丹種植區(qū)（34°64′21″N，112°45′36″E），采樣品種為洛陽(yáng)紅，已種植10 a。當(dāng)?shù)啬昶骄鶜鉁丶s15 ℃，年降雨量約630 mm。2018 年3 月發(fā)現(xiàn)該種植區(qū)中部分牡丹植株生長(zhǎng)衰弱，葉片變小、發(fā)黃或泛紅，枝條細(xì)弱，呈根腐病典型發(fā)病癥狀。在種植區(qū)中選擇典型根腐病病株15 株，采集其發(fā)病根部組織，作為牡丹根腐病病株樣本（PDR），并于管理一致的種植區(qū)內(nèi)采集健康牡丹根部組織樣本（距離采樣根腐病植株樣本500 m 以外）作為牡丹健株樣本（PHR）。采用5點(diǎn)取樣法，每5 棵牡丹記為1 次重復(fù)，根腐病病株和健株樣本各3 次重復(fù)，分別標(biāo)記為PDR1—3 和PHR1—3。將采集的樣本裝入無(wú)菌袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)試驗(yàn)，根部組織表面用無(wú)菌水沖洗干凈，用70%乙醇浸泡30 s，用5%次氯酸鈉溶液消毒3 min，再用無(wú)菌水沖洗5 次，晾干，用于組織樣本DNA的提取。

1.2 樣本DNA提取與測(cè)序

采 用FastDNA?SPIN Soil for kit 試 劑 盒（MP Biomedicals，Solon，USA）提取牡丹根部組織DNA；利用Nanodrop 2000（Thermo Scientific，Wilmington，USA）檢測(cè)DNA 樣本的濃度和純度；利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)合格的DNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

以牡丹根部組織樣本DNA 為模板，使用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V5—V7 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；使用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCG TTCTTCATC GATGC-3′）對(duì)真菌ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后取3μL 利用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物純化后利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

利用Trimmomatic 0.33 軟件和FLASH 1.2 軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，過(guò)濾掉低質(zhì)量的Read序列，并將得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成Tag，利用UCHIME 8.1 軟件去除低質(zhì)量的Tag 和嵌合體。使用UPARSE 7.1 軟件對(duì)有效Tag 在97%的相似度水平下聚類(lèi)成為操作分類(lèi)單元（Operational taxonomic units，OTU）?；赟ilva 細(xì)菌分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)和Unite 真菌分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用RDP Classifier 2.11 軟件對(duì)OTU 進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)眯哦乳撝禐?.7，得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，進(jìn)而在各水平統(tǒng)計(jì)樣本群落組成。利用Mothur 1.30 軟件評(píng)估樣本的Alpha多樣性指數(shù)，用QIIME 1.9.1軟件進(jìn)行樣本Beta多樣性分析，利用FUNGuild 軟件對(duì)真菌分類(lèi)進(jìn)行注釋[8]。以上分析利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger 生信云網(wǎng)站平臺(tái)（http://www.i-sanger.com/project/index.html）完成，所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R3.1.2（http://www.r-project.org/）軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹根部組織樣本微生物基因序列深度分析和數(shù)據(jù)質(zhì)控

本研究采集了6 個(gè)牡丹根部組織樣本，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控，從6 個(gè)樣本中獲得細(xì)菌16S rRNA 基因V5—V7 區(qū)高質(zhì)量序列（Clean tag）136 078 條，每個(gè)樣本中Clean tag 數(shù)為15 866—24 869 條，序列平均長(zhǎng)度為377 bp；從6個(gè)樣本中獲得真菌ITS基因高質(zhì)量序列313 753 條，每個(gè)樣本中Clean tag 數(shù)為38 636—66 509條，序列平均長(zhǎng)度為238 bp。

2.2 牡丹根部組織樣本微生物OTU聚類(lèi)分析

在97%相似度水平對(duì)樣本序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，從健康牡丹根部組織中共鑒定獲得細(xì)菌21個(gè)門(mén)，40個(gè)綱，106 個(gè)目，196 個(gè)科，316 個(gè)屬，476 個(gè)種，632 個(gè)OTU；感染根腐病的根部樣本中共鑒定獲得細(xì)菌20個(gè)門(mén)，31 個(gè)綱，97 個(gè)目，169 個(gè)科，279 個(gè)屬，424 個(gè)種，564 個(gè)OTU。Venn 圖分析結(jié)果（圖1A、C）表明，在OTU 和屬水平，健株樣本與感染根腐病樣本之間細(xì)菌種類(lèi)較為接近，共有的OTU 和屬的種類(lèi)遠(yuǎn)高于2組樣本獨(dú)有的種類(lèi)。

從健康牡丹根部組織中共鑒定獲得真菌9 個(gè)門(mén)，31 個(gè)綱，64 個(gè)目，122 個(gè)科，184 個(gè)屬，223 個(gè)種，360 個(gè)OTU；感染根腐病的根部樣本中共鑒定出真菌7 個(gè)門(mén)，25 個(gè)綱，51 個(gè)目，84 個(gè)科，112 個(gè)屬，136個(gè)種，215 個(gè)OTU。Venn 圖分析結(jié)果（圖1B、D）表明，在OTU 和屬水平，健株樣本與感染根腐病樣本之間真菌種類(lèi)差異較大，共有的OTU 種類(lèi)低于2 組樣本獨(dú)有的種類(lèi)，在屬分類(lèi)水平上，健康組織樣本中獨(dú)有種類(lèi)也遠(yuǎn)高于2組樣本共有的種類(lèi)。

圖1 牡丹健株與根腐病病株根部組織中細(xì)菌和真菌群落比較Fig.1 Comparison of bacterial and fungal communities in the root tissues of healthy and root rot-diseased tree peony

2.3 牡丹根部組織樣本微生物Alpha多樣性分析

對(duì)健株根部組織和根腐病發(fā)病組織樣本中的細(xì)菌、真菌Alpha 多樣性指數(shù)ACE、Chao、Shannon、Simpson 及Sob 進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，ACE、Chao和Sob指數(shù)用于表示樣本細(xì)菌及真菌群落豐富度；Shannon、Simpson指數(shù)用于表示樣本中細(xì)菌及真菌群落多樣性。上述指數(shù)中，Simpson 指數(shù)值越大，表明樣本中群落多樣性越低，其余指數(shù)值越大，說(shuō)明樣本中群落豐富度和多樣性越高。由表1 可知，健株中細(xì)菌的ACE、Chao 和Sob 指數(shù)均高于病株，表明健株根部組織中細(xì)菌群落相對(duì)豐富，但差異不顯著；Shannon、Simpson指數(shù)與病株差異較小。以上表明，健株與病株組織樣本中細(xì)菌種群豐富度及多樣性差異均不明顯。同時(shí)，從表1可知，健株根部組織樣本中真菌的ACE、Chao 和Sob 指數(shù)均明顯高于病株，其Shannon 指數(shù)（P=0.04）、Simpson 指數(shù)（P=0.05）與病株具有顯著性差異，表明健株根部組織樣本中真菌豐富度和多樣性均高于病株。以上表明，健株與病株之間的細(xì)菌種群多樣性無(wú)顯著差別，但在真菌多樣性方面存在顯著差異，相比健株，病株中真菌種群多樣性顯著降低。

表1 牡丹健株與根腐病病株根部組織中細(xì)菌和真菌Alpha多樣性Tab.1 Alpha diversity of bacterial and fungal communities in the root tissues of healthy and root rot-diseased tree peony

2.4 牡丹根部組織樣本細(xì)菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，在門(mén)水平上，健康牡丹根部組織樣本中細(xì)菌種群主要分布在放線菌門(mén)（Actinobacteria，58.55%）、變形菌門(mén)（Proteobacteria，36.87%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，0.92%）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi），0.81%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria，0.74%）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes，0.70%）；根腐病發(fā)病根部組織樣本中細(xì)菌種群主要分布在變形菌門(mén)（70.9%）、放線菌門(mén)（21.16%）、擬桿菌門(mén)（6.08%）、酸桿菌門(mén)（1.04%）、綠彎菌門(mén)（0.09%）和厚壁菌門(mén)（0.05%）。細(xì)菌群落組成表明，與健株相比，患病根部組織中變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度增加，分別增加34.03、5.16、0.30 個(gè)百分點(diǎn)；而放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度降低，分別降低37.39、65.00、0.72個(gè)百分點(diǎn)。

圖2 牡丹根部組織樣本細(xì)菌門(mén)水平上群落的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial communtiy in tree peony root tissues samples at phylum level

由圖3可知，在屬水平上，健康牡丹根部組織中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬主要為假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia,14.90%）、植物棲居菌屬（Phytohabitans，8.50%）、分枝 桿 菌 屬（Mycobacterium, 6.49%）、Norank_f__Rhodobacteraceae（5.39%）、弗蘭克菌屬（Frankia,4.58%）、固 醇 桿 菌 屬（Steroidobacter, 2.84%）、Unclassified_f__Burkholderiaceae（1.94%）、鏈霉菌屬（Streptomyces, 1.41%） 和 Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium（1.01%）。根腐病發(fā)病根部組織樣本中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬主要為Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium（12.14%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.56%）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium，5.63%）、鏈霉菌屬（4.97%）、Unclassified_f__Burkholderiaceae（4.57%）、鞘脂菌屬（Sphingobium, 3.90%）、固醇桿菌屬（3.22%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（2.23%）、Unclassified_f__Microscillaceae（1.74%）、假諾卡氏菌屬（1.48%）。健株與根腐病發(fā)病組織樣本中共有細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬5個(gè)，分別為假諾卡氏菌屬、固醇桿菌屬、Unclassified_f__Burkholderiaceae、鏈霉菌屬 和 Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium。其中，健康組織樣本中獨(dú)有的屬為植物棲居菌屬、分枝桿菌屬、弗蘭克菌屬和Norank_f__Rhodobacteraceae；患病組織樣本中獨(dú)有的屬為假單胞菌屬、新鞘氨醇桿菌屬、鞘脂菌屬、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia 和 Unclassified_f__Microscillaceae。以上表明，與健株相比，患病根部組織中的Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、鏈霉菌屬、Unclassified_f__Burkholderiaceae和固醇桿菌屬等細(xì)菌屬的相對(duì)豐度有所增加，分別增加11.13、3.56、2.63、0.38個(gè)百分點(diǎn)；而假諾卡氏菌屬的相對(duì)豐度顯著降低，降低了13.42 個(gè)百分點(diǎn)。同時(shí)推測(cè)病株樣本中獨(dú)有的屬如假單胞菌屬、新鞘氨醇桿菌屬、鞘脂菌屬的出現(xiàn)可能與牡丹根腐病的發(fā)生關(guān)系密切。

圖3 牡丹根部組織樣本細(xì)菌屬水平上群落的相對(duì)豐度（相對(duì)豐度＞0.05）Fig.3 Relative abundance of bacterial communtiy in tree peony root tissues samples at genus level（The relative abundance ＞0.05）

2.5 牡丹根部組織樣本真菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知，在門(mén)水平上，健康牡丹根部組織樣本中真菌主要分布在子囊菌門(mén)（Ascomycota，79.04%）、擔(dān) 子 菌 門(mén)（Basidiomycota，12.60%）、Unclassified_k__Fungi （7.02%） 、羅 茲 菌 門(mén)（Rozellomycota，0.77%）和其他（0.54%）；根腐病發(fā)病根部組織樣本中真菌主要分布在子囊菌門(mén)（77.43%）、擔(dān)子菌門(mén)（21.81%）、其他（0.48%）和Unclassified_k__Fungi（0.22%）。真菌群落組成表明，與健株相比，患病根部組織中擔(dān)子菌門(mén)真菌的相對(duì)豐度明顯增加，增加了9.21 個(gè)百分點(diǎn)；而子囊菌門(mén)真菌的相對(duì)豐度有所降低，降低了1.61 個(gè)百分點(diǎn)。

圖4 牡丹根部組織樣本真菌門(mén)水平上群落的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of fungal community in tree peony root tissues samples at phylum level

由圖5可知，在屬水平上，健康牡丹根部組織中真菌優(yōu)勢(shì)屬主要為Unclassified-p-Ascomycota（21.46%） 、其 他（21.46%） 、擬 折 孢 屬（Minimelanolocus， 13.03%） 、 Unclassified_c__Sordariomycetes（9.89%） 、Unclassified_k__Fungi（7.04%）、外 瓶 霉 屬（Exophiala，5.93%）、Cutaneotrichosporon（5.82%）、交鏈孢屬（Alternaria，3.82%）、Unclassified_o__Chaetothyriales（2.35%）、Hymenula（1.25%）、Dactylonectria（1.24%）；根腐病發(fā)病根部組織中真菌優(yōu)勢(shì)屬分別為Hymenula（31.96%）、其他（17.99%）、Kurtzmanomyces（15.58%）、Dactylonectria（12.93%）、Unclassified_f__Nectriaceae（9.36%）、Unclassified_o__Hypocreales（5.58%）、Cuniculitrema（4.04%）、Unclassified-p-Ascomycota（3.18%）、乳 突 赤 殼 屬（Thelonectria，3.13%）、Unclassified_o__Sordariales（2.56%）、Unclassified_o__Helotiales（2.05%）、外瓶霉屬（1.52%）。健株與根腐病發(fā)病組織樣本中共有真菌優(yōu)勢(shì)屬4 個(gè)，分別為Unclassified-p-Ascomycota、外瓶霉屬、Hymenula和Dactylonectria。其中，健康組織樣本中獨(dú)有的屬為擬 折 孢 屬 、Unclassified_c__Sordariomycetes、Cutaneotrichosporon、Unclassified_k__Fungi、交 鏈 孢屬和Unclassified_o__Chaetothyriales；患病組織樣本中獨(dú)有的屬為Kurtzmanomyces、Unclassified_f __Nectriaceae 、Unclassified _ o __ Hypocreales 、Cuniculitrema、乳 突 赤 殼 屬、Unclassified_o__Sordariales、Unclassified_o__Helotiales。以上表明，與健株相比，患病根部組織中的Hymenula和Dactylonectria屬相對(duì)豐度顯著增加，分別增加30.71、11.69 個(gè) 百 分 點(diǎn)，Unclassified-p-Ascomycota和外瓶霉屬真菌相對(duì)豐度明顯降低，分別降低為18.28、4.41 個(gè)百分點(diǎn)。同時(shí)推測(cè)病株樣本中獨(dú)有的屬如Kurtzmanomyces、Unclassified_f__Nectriaceae 和Unclassified_o__Hypocreales 的出現(xiàn)可能與牡丹根腐病的發(fā)生關(guān)系密切。

圖5 牡丹根部組織樣本真菌屬水平上群落的相對(duì)豐度（相對(duì)豐度＞0.05）Fig.5 Relative abundance of fungal community in tree peony root tissues samples at genus level（The relative abundance ＞0.05）

2.6 牡丹根部組織樣本間微生物Beta多樣性分析

樣本距離Heatmap能夠反映樣本間群落組成的差異，基于Weighted unifrac 距離算法獲得細(xì)菌距離Heatmap，由圖6A 可知，健株與病株根部組織樣本間最大距離值為0.500，表明健株與病株根部組織樣本間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有一定的差異；基于Weighted unifrac 距離算法獲得真菌距離Heatmap，由圖6B 可知，健株與病株根部組織樣本間最大距離值為1.339，表明健株和病株根部組織樣本間真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在顯著的差異。以上表明，牡丹健株與病株根部組織樣本間細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性均存在一定的差異，但真菌菌群結(jié)構(gòu)差異明顯，表明牡丹根腐病的發(fā)生對(duì)牡丹根部組織中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響較小，但顯著改變了牡丹根部組織中真菌的菌群結(jié)構(gòu)。

圖6 牡丹根部組織樣本細(xì)菌（A）和真菌（B）OTU水平距離HeatmapFig.6 Heatmap of tree peony root tissues samples at bacterial（A）and fungal（B）OTU level

主成分分析（PCA）能夠反映樣本間群落組成的差異。健株與病株根部組織樣本間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析（圖7A）表明，OTU 水平下第1 主成分（PC1）、第2 主成分（PC2）可以解釋所有變量的44.16%、24.74%，2 個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率為71.90%，說(shuō)明其能夠表征微生物群落組成的特征。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，健康根部組織樣本主要位于第一、四象限，患病根部組織樣本主要位于第二、三象限，健株與病株根部組織樣本被明顯區(qū)分開(kāi)，表明健株與病株根部組織樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

健株與病株根部組織樣本間真菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析（圖7B）表明，OTU 水平下第1 主成分（PC1）、第2 主成分（PC2）可以解釋所有變量的42.84%、31.57%，2 個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率為74.41%，說(shuō)明其能夠表征微生物群落組成的特征。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，健康根部組織樣本主要位于第一象限，患病根部組織樣本主要位于第三、四象限，健株與病株根部組織樣本被明顯區(qū)分開(kāi)，表明健株與病株樣本間真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

圖7 牡丹根部組織樣本細(xì)菌（A）和真菌（B）OTU水平主成分分析Fig.7 Principal component analysis of tree peony root tissues samples at bacterial（A）and fungal（B）OTU level

2.7 牡丹根部組織樣本真菌功能類(lèi)群預(yù)測(cè)分析

利用FUNGuild軟件對(duì)真菌分類(lèi)進(jìn)行注釋?zhuān)Y(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8 可知，患病根部組織中植物病原菌（Plant pathogen）占所有真菌OTU 的27.41%，健康根部組織中植物病原菌僅占所有真菌OTU 的0.04%；患病根部組織中未定義的腐生菌（Undefined saprotroph）（27.38%）的OTU 豐度也顯著高于健株（0.10%）；健康根部組織中未知真菌（Unknown，45.20%）的OTU豐度顯著高于病株（12.31%）。以上表明，牡丹發(fā)生根腐病后，其植物病原菌和腐生菌數(shù)量在根部組織中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且真菌種群多樣性顯著減低。

圖8 牡丹健株與根腐病病株根部組織中真菌OTU水平功能注釋Fig.8 Function annotation at fungal OTU level in the root tissues of the healthy and root rot-diseased tree peony

3 結(jié)論與討論

研究表明，植物根際、根內(nèi)微生物群落組成與植物土傳病害的發(fā)生具有一定的關(guān)系，豐富的根際、根內(nèi)微生物種類(lèi)能顯著提高植物抑制土傳病害發(fā)生的能力[9-10]。本研究中所有樣本OTU 聚類(lèi)及Alpha 多樣性分析表明，牡丹根腐病病株中細(xì)菌OTU 種類(lèi)有所降低，種群的豐富度和多樣性與健株差異不顯著；但健株與根腐病病株間真菌種群多樣性差異顯著，健株中真菌OTU 種類(lèi)和種群多樣性顯著高于病株，這個(gè)結(jié)果與前人研究相一致。如SHANG 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，健康蘭州百合根際土壤中的真菌多樣性顯著高于根腐病發(fā)病土壤；鄭元仙等[12]研究發(fā)現(xiàn)，感染根腐病的煙株根際土壤真菌群落多樣性水平顯著低于健康煙株的根際土壤；文永均等[13]研究發(fā)現(xiàn)，健康三七根際土和根內(nèi)生真菌多樣性高于患根腐病三七，且根際土壤中真菌的種群多樣性顯著高于根內(nèi)真菌的種群多樣性。總體看來(lái)，植物根際、根內(nèi)微生物群落是一個(gè)綜合體，植物病害的發(fā)生與根際、根內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)失衡關(guān)系密切。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析發(fā)現(xiàn)，病株與健株組織中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)組成基本相似，其中患病根部組織中變形菌門(mén)相對(duì)豐度明顯增加，但是放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度明顯降低。楊光柱等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果根腐病病株根際土壤中細(xì)菌變形菌門(mén)的相對(duì)豐度高于健株，其放線菌門(mén)的相對(duì)豐度低于健株，與本研究結(jié)果相一致。變形菌是一類(lèi)適應(yīng)性相對(duì)較強(qiáng)的細(xì)菌，既包含引起動(dòng)植物生病的病原菌種類(lèi)，也包含抑制致病菌的有益菌種類(lèi)[15]。放線菌門(mén)細(xì)菌含量通常反映土壤的健康狀況，其豐度越高，代表土壤質(zhì)量較高，植物生長(zhǎng)狀況較好[16-17]。本研究中，健康牡丹組織樣本中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于患病植株，可推測(cè)相對(duì)于感染根腐病的植株而言，健株能夠招募土壤中更多的放線菌進(jìn)入根部組織，改善其生長(zhǎng)狀況，提高其抗病能力。同時(shí)研究表明，牡丹根系分泌物和脫落物成分復(fù)雜，其成分的微小變化可引起根際微生物區(qū)系組成上的巨大差異[18-19]，因此，推測(cè)患病牡丹植株中變形菌數(shù)量的增加，可能與患病植株中牡丹根系分泌物的改變有關(guān)系。

在細(xì)菌屬水平上，牡丹根腐病病株與健株組織樣本間也存在差異，患病植株中假單胞菌屬和新鞘氨醇桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。研究表明，假單胞菌屬細(xì)菌既是根際促生菌和植物組織內(nèi)生菌的主要種類(lèi)，同時(shí)又是侵染多種植物的病原菌[20-21]。向立剛等[22]研究發(fā)現(xiàn)，感染青枯病的煙株根際土壤樣本中假單胞菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度高于健株。新鞘氨醇桿菌屬細(xì)菌作為降解菌，也廣泛存在于植物根際，如孫會(huì)忠等[23]在牡丹（鳳丹）根際土壤中分離獲得了1 株具有良好解磷活性的解磷菌Novosphingobiumsp.YF20。本研究中牡丹根腐病病株中假單胞菌屬和新鞘氨醇桿菌屬相對(duì)豐度的增加，是否為牡丹在感病條件下，應(yīng)急招募更多的有益細(xì)菌，以緩解病害的發(fā)生，或這些細(xì)菌種群相對(duì)豐度的增加加重了根腐病的發(fā)生，仍需做進(jìn)一步的研究和探討。

真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析發(fā)現(xiàn)，病株與健株中真菌優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)組成基本相似，其病株根部組織中擔(dān)子菌門(mén)真菌的相對(duì)豐度有所增加，而子囊菌門(mén)真菌相對(duì)豐度降低，但降低幅度不明顯。宋旭紅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃連感染根腐病后，其根際土壤中擔(dān)子菌門(mén)真菌的豐度有所增加；另有研究者發(fā)現(xiàn)，三七感染根腐病后，其根內(nèi)子囊菌的豐度有所降低[13]，這與本研究結(jié)果基本一致。子囊菌門(mén)真菌包含了植物常見(jiàn)的內(nèi)生菌種類(lèi)，主要參與土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解和養(yǎng)分循環(huán)，其含量降低可能會(huì)導(dǎo)致土壤肥力的下降[25]。擔(dān)子菌門(mén)真菌種類(lèi)繁多，部分種類(lèi)能夠與植物共生形成菌根，同時(shí)又有一些種類(lèi)作為植物病原菌導(dǎo)致植物病害的發(fā)生。本研究中擔(dān)子菌門(mén)真菌豐度增加顯著，推測(cè)其部分種類(lèi)可能為牡丹根腐病病原菌，導(dǎo)致其在發(fā)病根部組織占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

真菌屬水平上，牡丹病株與健株樣本之間存在顯著差異，患病植株中Dactylonectria屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，目前Dactylonectria屬真菌作為植物根腐病的病原菌相繼被報(bào)道：LI等[26]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，D.torresensis為云南白芨根腐病的主要致病菌；ZHANG 等[27]報(bào)道，D.novozelandica可引起三七根腐病的發(fā)生。本研究中，Dactylonectria屬真菌在病株根部組織中顯著增加，推測(cè)Dactylonectria屬真菌也可能引起牡丹根腐病的發(fā)生，但前期研究認(rèn)為牡丹根腐病的病原菌主要為鐮刀菌屬真菌[2]。因此，僅采用傳統(tǒng)分離方法對(duì)土傳病害病原菌進(jìn)行分離鑒定，并不能夠深入了解牡丹根腐病的病原菌種類(lèi)，高通量測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)平板分離法的有機(jī)結(jié)合，將有助于更好地解析牡丹根腐病的病原菌種類(lèi)及發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，牡丹感染根腐病后，其根部組織中細(xì)菌、真菌群落豐富度均減低，真菌種群多樣性與健株存在顯著差異，與根腐病發(fā)病相關(guān)的病原菌Dactylonectria屬及叢赤殼科真菌相對(duì)豐度顯著增加，表明病原菌數(shù)量的變化導(dǎo)致牡丹根部組織中真菌種群多樣性的降低，真菌種群平衡被破壞，從而導(dǎo)致根腐病的發(fā)生。同時(shí)，本研究中健康牡丹根部組織中假諾卡氏菌和植物棲居菌相對(duì)豐度較高，假諾卡氏菌為一類(lèi)稀有放線菌，可產(chǎn)生一些重要抗生素類(lèi)活性次生代謝產(chǎn)物，可作為植物促生菌改善植物的生長(zhǎng)狀況[28]；植物棲居菌主要是來(lái)自植物組織內(nèi)部的一類(lèi)放線菌，可產(chǎn)生多樣化和新穎的次生代謝產(chǎn)物[29]。因此在后續(xù)試驗(yàn)中，可進(jìn)一步分離純化健康根部組織中的內(nèi)生放線菌，并驗(yàn)證菌株及次生代謝產(chǎn)物對(duì)牡丹根腐病的生防效果，可為牡丹根腐病的防治提供具有生防潛能的微生物資源。