■陳 燕 王湘君 陳 文 匡浩宇 周 琪 王偉康 陳 冰

（1.海南熱帶海洋學院，海南三亞 572022；2.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室，海南三亞 572022；3.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，廣東廣州 510640）

魚類是優(yōu)質食物蛋白源，能為人體各階段生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質?；谒a養(yǎng)殖的快速發(fā)展和魚粉供應的日益短缺，用價廉、質量高的動植物蛋白源替代水產飼料中昂貴的魚粉是保護海洋漁業(yè)資源和確保海洋生物可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。黑水虻（Hermetia illucens, Black sodier fly meal, BSFL）是一種以腐食性生物（如畜禽的糞便、生活垃圾等）為食的，能將廢物轉化為富含氨基酸和脂肪酸的優(yōu)質昆蟲蛋白，具有繁殖周期短、生長迅速、世代間隔短、飼養(yǎng)簡單的優(yōu)點，國內外新型流行的飼料用蛋白源[1]。與魚粉相比，黑水虻含有與魚粉必需氨基酸模式相似的多種必需氨基酸，且其中的蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸的含量較高，還富含不飽和脂肪酸和必需脂肪酸，特別適合于替代水產飼料中的魚粉[2-3]（見表1、表2）。

表1 黑水虻幼蟲和魚粉之間必需氨基酸的比較(mg/g)[2-3]

表2 黑水虻幼蟲中不飽和脂肪酸的含量(%)[2-3]

魚類腸道微生物被認為對宿主的生命活動起重要的作用，其中的有益菌屬可通過改善宿主的免疫、營養(yǎng)吸收和內環(huán)境等來促進宿主生長發(fā)育[4-8]。魚類腸道菌群結構受水體環(huán)境[4]、攝食類型[5]、發(fā)育階段[6]、營養(yǎng)生物節(jié)律[7]等因素的影響。宏基因組學（Metagenomics）即微生物環(huán)境基因組學，研究手段有全宏基因組技術和16S rRNA 片段擴增技術。物種間16S rRNA 序列既有高變區(qū)（V 區(qū)，物種之間有差異）也有保守區(qū)（物種之間高度相似），其中的V4～V5區(qū)特異性好，數據庫信息全，是細菌多樣性分析注釋的最佳選擇。因此，16S rRNA 也被稱為細菌系統(tǒng)分類研究中最常用的和最有用的分子鐘。前期試驗已經采用不同比例的黑水虻替代魚粉研究對石斑魚的影響，篩選出黑水虻和魚粉的最佳比例，建立了針對養(yǎng)殖石斑魚的飼料配方。豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus），隸屬于石斑魚亞科，其肉質細膩、營養(yǎng)全面，且體色艷麗，是一種具有較高的營養(yǎng)、經濟和觀賞價值的海水魚類。日常生活中，豹紋鰓棘鱸體色與其經濟價值和觀賞價值密切相關，故對該種魚的體色進行研究很有實際意義。迄今，關于魚類體色的研究已有一些報道[9-10]，但涉及豹紋鰓棘鱸的研究不多。

蝦青素是一種3, 3-二羥基-4, 4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，呈亮紅色橙色，由一些植物、微藻和微生物合成[11]。天然蝦青素主要來源于雨生紅球藻[12]。蝦青素因其抗氧化力和多種生物功能(如皮膚或皮膚色素沉著、增強免疫力、緩解壓力以及對生長性能和生存的積極影響)，作為飼料添加劑廣泛應用于水產養(yǎng)殖業(yè)[9-10，13-15]。關于在昆蟲蛋白和魚粉最佳配比基礎下添加蝦青素對豹紋鰓棘鱸膚體色、肌肉組織形態(tài)和腸道菌群的影響尚未見報道。

本試驗以豹紋鰓棘鱸為研究對象，探究在最佳的昆蟲蛋白源和魚粉配比的基礎飼料中添加不同水平蝦青素對其體色、肌肉組織結構和腸道微生物的影響，進而為豹紋鰓棘鱸養(yǎng)殖產業(yè)的健康發(fā)展提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 飼料配方和養(yǎng)殖試驗

按照豹紋鰓棘鱸的營養(yǎng)需求，其配合飼料中的蛋白質源由魚粉（FM）和黑水虻幼蟲粉提供，脂肪源為魚油和大豆油，小麥粉為碳水化合物源，按前期研究結果設計基礎飼料配方（見表3），分別向基礎飼料中添加0、0.025%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的蝦青素配制了6 種等氮等能的飼料，標記為D 0、D 0.025%、D 0.05%、D 0.10%、D 0.15%、D 0.20%組。試驗所用蝦青素由德國巴斯夫（BASF）中國有限公司提供，蝦青素主要提取于雨生紅球藻，濃度為10%。

表3 試驗飼料組成及主要營養(yǎng)水平（干物質組成）

豹紋鰓棘鱸飼養(yǎng)試驗在海南陵水德林誠信水產有限公司基地室內循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展。商業(yè)飼料每天喂食2 次，暫養(yǎng)2 周。正式試驗開始后，禁食24 h，然后540 條魚將隨機分布在室內海水循環(huán)系統(tǒng)（500 L/箱、30 尾/箱），3 個重復組。每日投喂2 次（上午08：00；下午16：00），并記錄日攝食量和死亡數。每周進行1次海水交換（30%的系統(tǒng)容量）。在整個試驗過程中，使用便攜式多探頭水表監(jiān)測水質，其中溶氧保持7.0 mg/L以上，水溫28.0～29.0 ℃。

1.2 樣品收集和指標測定

養(yǎng)殖周期結束后，每個養(yǎng)殖箱隨機抓取10 尾豹紋鰓棘鱸，用MS-222 對取樣的魚進行麻醉。使用濾紙吸干豹紋鰓棘鱸體表水分，然后選用CR-400 色彩色差計測量魚類體色，分別檢測豹紋鰓棘鱸的背部和腹部的亮度（L*）、紅色（a*）和黃色（b*）。

測定魚類體色后，冰上解剖，摘取豹紋鰓棘鱸背部、腹部皮膚和肌肉測定總類胡蘿卜素含量?？傤惡}卜素測定方法按照陳秀梅[16]所述的方法。

類胡蘿卜素含量（F，mg/kg）=[（吸光值×常數（104）×提取液體積（mL）]/[（吸光系數（2 500）×樣品濕重（g）]

1.3 組織切片制作及觀察

按以上同樣的方法，摘取養(yǎng)殖魚背部肌肉，并切成1 cm×1 cm左右的塊狀并用4%多聚甲醛固定。采用蘇木精-伊紅（H.E.）染色法進行染色[按照病理實驗檢測SOP 程序進行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片）并于全景切片掃描儀[3DHISTECH（Hungary），PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000]和正置白光拍照顯微鏡（Nikon，Japan，Eclipse Ci-L）進行圖片采集。

1.4 16S rRNA基因測序

按以上同樣的方法將魚麻醉并于冰上解剖，每個養(yǎng)殖缸隨機抓取5尾魚于無菌條件下將致死的豹紋鰓棘鱸腸道內的樣品擠出，腸道樣品-80 ℃冷凍備用。使用DNA提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用Power Soil DNA Isolation Kit（MoBio）檢測DNA 濃度。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴增V3 和V4 區(qū)。通過高通量測序對16S rRNA基因V4～V5區(qū)進行分析并對腸道細菌群落進行表征?；跀祿换蟮腛TU物種豐度譜，再對OTU 進行豐度、多樣性指數等分析，同時對物種注釋，在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析（見圖1）。

圖1 16S rRNA基因測序流程

2 結果與分析

2.1 蝦青素對豹紋鰓棘鱸皮膚色度值的影響（見表4）

從表4中可見，蝦青素使豹紋鰓棘鱸的背部和腹部體色L*值變?。ǜ共緿 0.10%組除外），但背部D 0.15%組L*值與對照組差異不顯著（P＞0.05），而腹部D 0.10%組L*值顯著高于對照組（P＜0.05），說明D 0組（對照組）的魚背部和腹部體色除背部D 0.15%組和腹部D 0.10%組除外較其他各組的要明亮。蝦青素能使豹紋鰓棘鱸的體色a*值變大，即D 0.20%組的豹紋鰓棘鱸體表紅色比D 0組（對照組）的更明顯，尤其對D 0.10%組和D 0.15%組的腹部影響更大。蝦青素能使豹紋鰓棘鱸的體色b*值變大，即飼料中添加不同水平蝦青素比D 0組（對照組）能使豹紋鰓棘鱸的體色呈現黃色，尤其對D 0.10%組和D 0.15%組的腹部影響最大。總體而言，D 0.10%組和D 0.15%組蝦青素對豹紋鰓棘鱸體色a*值和b*值影響最為明顯。

表4 蝦青素對豹紋鰓棘鱸皮膚色度值的影響

2.2 蝦青素對豹紋鰓棘鱸背部、腹部和肌肉總類胡蘿卜素含量的影響（見表5）

表5 蝦青素對豹紋鰓棘鱸背部、腹部皮膚和肌肉總類胡蘿卜素含量的影響（mg/kg）

從表5可以看出，隨著飼料中不同水平蝦青素的添加，背部、腹部和肌肉總類胡蘿卜素含量均與對照組存在顯著性差異（P＜0.05），其中D 0.10%組和D 0.15%組的豹紋鰓棘鱸背部、腹部和肌肉總類胡蘿卜素含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3 蝦青素對豹紋鰓棘鱸肌肉組織結構的影響（見圖2）

由圖2可知，a～f和A～F分別對應是D 0、D 0.025%、D 0.05%、D 0.10%、D 0.15%組和D 0.20%組豹紋鰓棘鱸肌肉組織結構在40×和400×放大倍率下的觀察。飼料中添加不同水平的蝦青素對豹紋鰓棘鱸肌肉組織結構無顯著性影響。各組組織切片顯示肌肉切面可見肌細胞邊界清晰、排列整齊、走形一致，高倍下的肌細胞橫紋清晰，未出現變性和壞死；未看見結締組織的增生與炎性細胞的浸潤。

圖2 蝦青素對豹紋鰓棘鱸肌肉組織結構的影響

2.4 蝦青素對豹紋鰓棘鱸腸道菌群的影響

2.4.1 下機數據處理（見表6）

采用Illumina MiSeq/HiSeq 測序平臺得到的下機數據（Raw Data）經過數據拆分、去引物序列、PE Reads 拼接、Tags 質量及長度過濾和截取以及去嵌合體后獲得最終的有效數據（Effective Tags），具體的數據產出統(tǒng)計結果見表6。基于OTU的絕對豐度及注釋信息，將各組數據進行不同分類水平[界（Kingdom），門Phylum，綱（Class），目（Order），科（Family），屬（Genus），種（Species）]展示，可精確到“屬”水平。

表6 數據預處理統(tǒng)計及質控

2.4.2 腸道微生物的變化

圖3為豹紋鰓棘鱸腸道提取物測序統(tǒng)計各分類水平的物種在每個樣本中的相對豐度，圖3a，圖3b，圖3c、圖3d、圖3e分別為各分類水平腸道菌群的直方圖。門級水平上前6種優(yōu)勢菌群（相對豐度＞1%）為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋菌門（Spirochaetes）、OD1菌門，其中前4種為主要的菌群。各組魚腸道菌群（前4種）分別占比：D 0組：55%、15%、6%、6%；D 0.025%組：39%、24%、7%、26%；D 0.05%組：31%、24%、15%、11%；D 0.10%組：37%、32%、8%、8%；D 0.15%組：38%、30%、11%、9%；D 0.20%組：29%、39%、15%、9%（見表7）。屬級水平的屬科有15種，其中屬于變形菌門的有5種，分別是寡養(yǎng)單細胞屬（Stenotrophomonas）、青枯菌屬（Ralstonia）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、不動桿菌屬（Acinetobater）、假單胞菌屬（Pseudomnas）；屬于厚壁菌門的有6種，分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、嗜胨菌屬（Pepeoniphilus）、Allobaculum菌屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）；屬于擬桿菌門的有普氏菌屬（Prevotella）、Sediminibacterium菌屬、類桿菌屬（Bacteroides）；放線菌門的有棒狀桿菌屬（Corynetobacterium）。其他菌群如放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍菌門（Cyanobacteria）等，這些菌群組成復雜繁多故不一一例舉。

表7 豹紋鰓棘鱸腸道微生物門級對比(%)

圖3 豹紋鰓棘鱸腸道提取物測序物種的相對豐度

3 討論

在本試驗條件下，添加蝦青素D 0.10%組和D 0.15%組豹紋鰓棘鱸背部和腹部的紅色值和黃色值最大，顯著高于D 0 組，促使其背部和腹部變紅；此外，D 0.15%、D 0.20%組豹紋鰓棘鱸背部、腹部和肌肉中類胡蘿卜素含量也最高，顯著高于對照組。研究表明，在黃顙魚[16]、大鱗副泥鰍[17]、金曼龍魚（Trichogaster microlepis）[16]、東星斑[18]、錦鯉（Cyprinus carpioL.）[19]和血鸚鵡[20]飼料中添加100～200 mg/kg 的蝦青素顯著改善了體色。在金曼龍魚中研究發(fā)現，色素主要沉積在魚皮、魚鱗和魚鰭表面[16]。目前，國內關于蝦青素在不同魚類的研究中，會因蝦青素的來源和蝦青素的計量單位不同（飼料中），其結果會有差異。但就有效成分而言，試驗設計的青蝦素含量基本在0～300 mg/kg 范圍（有效成分）或0～0.3%（占飼料的百分比）。本試驗中所用的蝦青素來源于雨生紅球藻源（10%），且為飼料中的含量，按有效成分計算本研究結果與以上試驗結果一致（100～150 mg/kg）。

魚類的背部和腹部肌肉部分是給人體提供優(yōu)質蛋白源的主要可食部分，其中的著色是大多數消費者所青睞之處，比如人們偏愛蝦青素含量高的粉紅色的三文魚肉。大多數水產動物及動物組織的顏色歸因于各種類胡蘿卜素的存在[21]。在大西洋鮭魚飼料中添加88.6 mg/kg 蝦青素增加了鮭魚肌肉中的色素沉著[22]。在虹鱒魚飼料中添加蝦青素含量從0 增加到27.6 mg/kg，導致肌肉中總類胡蘿卜素含量和肌肉色度值增加。隨著蝦青素含量從27.6 mg/kg 增加到46.1 mg/kg，總類胡蘿卜素含量和色度值沒有明顯增加[23]。體色是魚類的重要遺傳性狀之一，除了受外界因素（如外源性添加劑）的影響外，還受到生理狀態(tài)以及體色基因（如SOX10和MITF基因）的調控的影響。在對大鱗副泥鰍的研究結果表明，SOX10和MITF在大鱗副泥鰍皮膚和肌肉中均表達，且飼料中添加150 mg/kg蝦青素對各組大鱗副泥鰍皮膚和肌肉組織中SOX10和MITE基因表達量均有顯著性影響[24]。本研究中未涉及相關調控基因的測定，是否也存在以上類似的現象，有待進一步研究分析。綜上所述，100～200 mg/kg蝦青素添加于魚類飼料中有助于體色中紅色色澤的改善。然而，當飼料中添加超過一定水平的蝦青素，體色色度值將沒有明顯增加，主要的原因可能是過量的蝦青素不能被魚類所充分吸收，故不能被沉淀[23]。

腸道中的微生物菌落和代謝產物直接宿主的營養(yǎng)、能量的吸收和代謝、腸道免疫功能等。在本試驗中，Illumina MiSeq/Hiseq 測序平臺用于研究豹紋鰓棘鱸腸道菌群組成，不同蝦青素對豹紋鰓棘鱸腸道菌群豐度影響較高的4 種菌門分別是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門，這與對斑點叉尾鮰、銀鯽和異育銀鯽腸道優(yōu)勢菌群的研究結論一致[25]。變形菌門是細菌中最大的菌門，大部分病原菌（如霍亂弧菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌、沙門氏菌等）都屬于變形菌門。研究顯示，導致生物功能障礙和疾病風險增加的有可能是變形菌門。放線菌門是水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的最大細菌門之一，具有較高的G+C含量[26]，并且一直是新型抗生素的極佳來源，屬于潛在益生菌。厚壁菌門中的某些細菌在促進腸道中纖維素分解和多糖發(fā)酵中起重要作用[27]，通過這樣的方式可以提高機體的免疫力[28]。擬桿菌屬被認為是宿主腸道中重要的微生物，可降解碳水化合物，例如多糖和蛋白質[29]。本試驗發(fā)現隨著飼料中添加的蝦青素的增加，變形菌門豐度在降低，說明飼料中添加適量的蝦青素有助于提高魚體的抗病力；而厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門這3種菌門豐度隨著飼料中的蝦青素水平的增加而增加，其中厚壁菌門、擬桿菌門在D 0.20%組時豐度達到最大，放線菌門隨飼料中蝦青素水平的增加，D 0.025%～D 0.20%組的放線菌門豐度均高于對照組，且在D 0.025%組時豐度達到最大。因此可見，豹紋鰓棘鱸魚養(yǎng)殖過程中在其飼料中添加蝦青素會改變其腸道菌群，在蝦青素添加量為0.20%時影響最大。

研究表明，在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）養(yǎng)殖中用適量黑水虻幼蟲喂養(yǎng)，改變了虹鱒的腸道菌群和食糜有關的菌群，提升了虹鱒腸道有益菌群的增加，改變有益菌群的多樣性[30-31]。綜上所述，應用黑水虻替代養(yǎng)殖過程的魚粉對水產動物的機體健康和生長并無不良影響，甚至適量地使用黑水虻代替魚粉有利于提升水產動物的生長性能，主要原因可能是黑水虻中的幾丁質和甲殼素可提升水產動物腸道有益菌群的多樣性。本試驗所用基礎飼料是含有10%的黑水虻幼蟲粉的配合飼料，在此基礎上添加蝦青素，飼料中隨著蝦青素的添加，特別是0.20%的添加有助于改變該種魚的腸道微生物的多樣性，是否與黑水虻幼蟲粉有關，有待進一步試驗考證。

4 結論

在黑水虻幼蟲粉和魚粉最優(yōu)配伍飼料配方基礎上，添加0.10%～0.15%（即100～150 mg/kg）蝦青素有助于使豹紋鰓棘鱸背部和腹部變紅和變黃，且對肌肉組織無影響，同時有利于提高腸道厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門等有益菌屬的多樣性和豐度，有利于提高豹紋鰓棘鱸機體的免疫力。由此說明在黑水虻幼蟲粉和魚粉最佳配伍基礎配方中添加蝦青素（雨生紅球藻源，10%）是可行的，添加0.10%～0.15%（即100～150 mg/kg）蝦青素有助于豹紋鰓棘鱸魚體色的增紅，推動水產養(yǎng)殖行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，增加收益。