■陳璟怡 王應(yīng)燃 韓 雪 陳 勇 舒 剛*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550000；3.貴州鳳和祥農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州黔東南 557400）

歸芪益母口服液為歸芪益母湯組方所制獸藥，歸芪益母湯又名當(dāng)歸補(bǔ)血湯，出自《內(nèi)外傷辨惑論》，由30 g黃芪和6 g當(dāng)歸組成處方，含有黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、多糖、芒柄花素、阿魏酸、毛蕊異黃酮等有效成分，其中黃芪味甘、性溫，能夠發(fā)揮益氣固表、補(bǔ)氣升陽功效；當(dāng)歸同樣味甘、性溫，可以養(yǎng)血補(bǔ)血，并促進(jìn)血液流通[1]?！杜＝?jīng)備要醫(yī)方》是在當(dāng)歸補(bǔ)血湯的基礎(chǔ)上，經(jīng)過改良和添加益母草制成的，也被稱為“歸芪益母湯”[2]。歸芪益母湯已在獸醫(yī)臨床取得廣泛應(yīng)用，該處方主要治療母畜的氣血兩虛，疲勞引起的嗜睡、產(chǎn)后瘀滯、腹痛、失血和發(fā)燒。后來研究發(fā)現(xiàn)，歸芪益母湯還可以極顯著增強(qiáng)機(jī)體的缺氧耐受力[3]，歸芪益母湯顯著抑制機(jī)體制造O2的能力，也顯著抑制了H2O2引起的細(xì)胞膜氧化溶血，降低自由基的產(chǎn)生，從而保證了組織的正常活力，可能還提高了小鼠對(duì)氧氣的耐受能力。此外，黃芪的有效成分以多糖、皂苷、黃酮等成分為主，發(fā)揮抗衰老、抗感染、細(xì)胞保護(hù)、抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和免疫增強(qiáng)等作用[4-5]。黃芪的抗菌作用表現(xiàn)在對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等都有較明顯的抑制作用[6]，當(dāng)歸性辛、甘、溫，其化學(xué)成分主要包括苯酚、香豆素、有機(jī)酸、氨基酸、多糖和類黃酮[7-8]，當(dāng)歸的有效成分可以抑制花生四烯酸代謝抗血小板聚集，干擾細(xì)胞內(nèi)鈣離子代謝，緩解血管平滑肌痙攣，以此緩解心腦缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[9]。

當(dāng)今規(guī)?；B(yǎng)殖時(shí)代，動(dòng)物經(jīng)常有細(xì)菌感染或炎癥發(fā)生，如果僅僅只采用西醫(yī)治療，不僅會(huì)增加動(dòng)物機(jī)體內(nèi)殘留的毒素，而且會(huì)導(dǎo)致抗藥性和耐藥性產(chǎn)生[10]，同時(shí)也可能使動(dòng)物肉制品危害人的食品安全[11]。因此開發(fā)新的中獸藥進(jìn)行環(huán)保無害的治療具有重要意義。雖然目前歸芪益母口服液主要運(yùn)用在母畜的產(chǎn)后護(hù)理上[12]，在抗菌抗炎鎮(zhèn)痛方面實(shí)際運(yùn)用的報(bào)道較少，但該組方中的單藥（如當(dāng)歸、黃芪等）均被報(bào)道具有抗菌、消炎鎮(zhèn)痛的藥理活性，本試驗(yàn)旨在研究歸芪益母口服液在動(dòng)物抗細(xì)菌感染和消炎鎮(zhèn)痛方面的作用效果，為歸芪益母口服液開發(fā)新的用途，同時(shí)也為動(dòng)物抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛方面用藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

大腸桿菌菌株（ATCC 25922）、沙門氏菌菌株（ATCC 10398）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)無特定病原體昆明（KM）雌性小鼠45 只（購自成都達(dá)碩生物科技有限公司）。

1.1.3 主要試劑歸芪益母口服液（北京生泰爾生物科技有限公司提供，批號(hào)20200131，每毫升相當(dāng)于1.2 g生藥）。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司）、熱板儀等。

1.2 方法

1.2.1 體外抑菌試驗(yàn)

配制菌懸液：將凍存菌種進(jìn)行活化處理，超凈工作臺(tái)紫外線照射15 min，使用75%乙醇棉球消毒包括手在內(nèi)的所有物品。再將菌種倒入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，通過稀釋涂布平板法確定菌液濃度。

抗菌活性初步篩選：抗菌活性最初的篩選是通過牛津杯法進(jìn)行的[13]。用生理鹽水將已知濃度的大腸桿菌和沙門氏菌溶液稀釋至10-7，在營養(yǎng)瓊脂板上，吸取200 μL 用涂布器均勻鋪開，然后用無菌鑷子將牛津杯均勻放置在板上，靜置后取200 μL 歸芪益母口服液，并針對(duì)每種細(xì)菌重復(fù)3組試驗(yàn)。在37 ℃環(huán)境培育平板12 h后，游標(biāo)卡尺確定抑菌圈直徑的大小。測試結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：極度敏感抑菌圈直徑大于20 mm；高度敏感15～19 mm；中度敏感10～14 mm；小于10 mm是低敏感的；0 mm是不敏感的[14]。

最小抑菌濃度（MIC）的測定：倍比稀釋歸芪益母口服液，即用普通肉湯將抗菌藥物稀釋成不同的濃度梯度，然后接種待測細(xì)菌以定量確定最小抑菌濃度。即使用96孔板，向一排孔的1～12孔中添加100 μL營養(yǎng)肉湯，然后將100 μL歸芪益母口服液添加到第1孔中，混合均勻取100 μL注入第2孔中混合后，混勻后取100 μL 移液到第3孔中，并按照此方法直到第10孔。以第11孔和第12孔中添加100 μL營養(yǎng)肉湯形成對(duì)照組。然后在第11孔中加入5 μL細(xì)菌懸液并充分混合，在孔12中加入等量的純化水，于37 ℃培育24 h，并觀察各孔中肉湯的澄清度。判斷標(biāo)準(zhǔn)：肉湯是透明的，表明細(xì)菌沒有生長；肉湯是混濁的，表明有細(xì)菌生長[15]。

最小殺菌濃度（MBC）的確定：將MIC測試中所述的無菌環(huán)境生成的肉湯100 μL吸取并滴入營養(yǎng)瓊脂平板中，均勻鋪開。同上37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察是否有細(xì)菌生長。結(jié)果判定：最小殺菌濃度為無菌生長的最高稀釋倍數(shù)[16]。

1.2.2 耳廓腫脹法

15只雌性小鼠被隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和空白組。試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和空白組每日一次連續(xù)15 d灌胃歸芪益母口服液、阿司匹林溶液和生理鹽水，灌服劑量根據(jù)小鼠體重按0.4 mL/20 g。在最后一次給藥30 min后，在小鼠右耳的兩側(cè)涂上二甲苯，并在涂抹處引起炎癥1 h 后將其處死。沿耳廓的基線切開兩只耳朵，在左耳和右耳上從對(duì)稱部位使用直徑為9 mm 的打孔器打孔并稱重，以所得數(shù)據(jù)計(jì)算耳廓腫脹程度和對(duì)耳廓腫脹的抑制率，作為評(píng)價(jià)藥物效果的指標(biāo)[17]。

耳廓腫脹度=右耳廓重量（g）-左耳廓重量（g）

腫脹抑制率（%）=（空白組腫脹度-試驗(yàn)組腫脹度）/空白組腫脹度×100[18]

1.2.3 熱板法

分組、劑量和給藥方式與1.2.2 相同，連續(xù)給藥15 d后，將小鼠放在（55.0±0.5）℃的熱板儀上，觀察小鼠從足底接觸熱板儀到出現(xiàn)舔后足狀態(tài)，即熱板反應(yīng)的潛伏期，并記錄潛伏期的時(shí)間長短作為疼痛閾值指標(biāo)，在10 min和20 min后再次測量[19]。在正式測試之前，要去除反應(yīng)潛伏期小于5 s 和大于30 s 的雌性小鼠，它們反應(yīng)太敏感或太遲鈍均為不合格。

1.2.4 醋酸扭體法

分組、劑量和給藥方式與1.2.2 相同，連續(xù)給藥15 d 后，向每組小鼠的腹腔中注入0.7%的冰醋酸（0.1 mL/10 g），通過伸展后肢、收縮腹部、抬高臀部等動(dòng)作，判斷小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)，并記錄小鼠15 min 內(nèi)的扭體次數(shù)，以計(jì)算出醋酸酸扭曲抑制率。

抑制率（%）=（空白組的次數(shù)-試驗(yàn)組的次數(shù)）/空白組的次數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌活性試驗(yàn)

2.1.1 抑菌試驗(yàn)（見表1）由表1可知，歸芪益母口服液對(duì)沙門氏菌有一定的抑菌作用，為中度敏感。

表1 歸芪益母口服液的體外抑菌作用

2.1.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度（見表2）

表2 歸芪益母口服液對(duì)菌種的MIC和MBC（g/mL）

由表2可知，歸芪益母口服液對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃為0.250 g/mL，最小殺菌濃度為0.250 g/mL，對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃為0.125 g/mL，最小殺菌濃度為0.125 g/mL。該結(jié)果說明歸芪益母口服液可對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌發(fā)揮抑制作用。

2.2 抗炎鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

2.2.1 耳廓腫脹法（見表3）

表3 歸芪益母口服液對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹抑制效果

與空白組相比，歸芪益母口服液和阿司匹林溶液都顯著抑制了二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹(P＜0.05)，且歸芪益母口服液的抗炎作用比阿司匹林弱。

2.2.2 熱板法（見表4）

表4 歸芪益母口服液對(duì)小鼠熱板致痛的影響(s)

對(duì)小鼠熱板舔足反應(yīng)潛伏期的影響，試驗(yàn)組痛閾值顯著大于空白組(P＜0.05)，且試驗(yàn)組的痛閾值大于陽性組。結(jié)果說明歸芪益母口服液和阿司匹林都可以抑制小鼠舔后足的疼痛反應(yīng)，同時(shí)歸芪益母口服液的鎮(zhèn)痛效果較好。

2.2.3 醋酸扭體法（見表5）

表5 歸芪益母口服液對(duì)醋酸引起小鼠扭體次數(shù)的影響

與空白組相比，試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組均可以顯著抑制乙酸引起的小鼠疼痛反應(yīng)(P＜0.05)。由表5 可知，試驗(yàn)組和陽性組對(duì)于空白組有顯著差異，均能抑制乙酸引起的小鼠疼痛反應(yīng)，歸芪益母口服液的療效更好，略優(yōu)于阿司匹林。

3 討論

中獸藥取材于來源廣泛的純天然植物，天然植物不僅對(duì)動(dòng)物生理功能沒有明顯毒副作用，也不對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生明顯損害，而且易于加工成散劑、丸劑、片劑、注射劑、栓劑、浸膏類制劑、湯劑等，易于對(duì)動(dòng)物給藥并各自具有優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出良好低依賴性和臨床效果。在獸醫(yī)臨床中發(fā)揮著很大的優(yōu)勢。歸芪益母口服液主要由當(dāng)歸、黃芪、川芎、益母草、枳殼組成。李谷才等[20]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中的黃酮類提取物有一定抑菌活性，也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪的皂苷類成分[21]和黃酮類[22]成分對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有較高的殺菌活性[23]。但在本次體外抑菌試驗(yàn)中，歸芪益母口服液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果不太理想，而對(duì)沙門氏菌抑菌圈直徑達(dá)12.26 mm，為中度敏感，MIC 結(jié)果為0.125 g/mL，對(duì)沙門氏菌有一定抑制作用，且二者M(jìn)BC試驗(yàn)中均表現(xiàn)出無殺菌活性，在殺菌方面效果不明顯。由試驗(yàn)結(jié)果可見，歸芪益母口服液對(duì)這兩種細(xì)菌的體外抑菌效果較差，可能與生產(chǎn)加工過程或者組方配比等因素有關(guān)系。

歸芪益母口服液暫未廣泛應(yīng)用于抗炎鎮(zhèn)痛方面，但其組方的主要成分黃芪已被廣泛報(bào)道于抗炎、抑菌的試驗(yàn)當(dāng)中[24]，黃芪多糖能有效調(diào)節(jié)Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路的活性，誘導(dǎo)機(jī)體抗炎反應(yīng)[25]，黃芪制劑也表現(xiàn)出良好的效果，如黃芪水提物對(duì)中性粒細(xì)胞具有明顯的抗炎作用[26]，植物乳桿菌發(fā)酵的黃芪可作為天然的抗氧化、抗炎劑[27]，以黃芪為原料制成的納米銀顆粒具有較好的抗氧化活性（64%）[23]，添加黃芪且作為主要成分的歸芪益母口服液也在試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗炎作用。同時(shí)研究也曾發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸和川芎合用具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用[28]。本試驗(yàn)還將歸芪益母口服液應(yīng)用在炎癥早期試驗(yàn)性腫脹、疼痛的抑制，觀察其對(duì)抗炎鎮(zhèn)痛的影響，來為產(chǎn)品的臨床實(shí)際用藥做出評(píng)估。在二甲苯法中與空白組有顯著差異腫脹抑制率達(dá)到了50.82%，熱板法小鼠痛閾值顯著大于空白組，醋酸扭體法中與空白組有顯著性差異，抑制率達(dá)到了62.82%。該試驗(yàn)結(jié)果表明歸芪益母口服液能對(duì)各致炎因子所致小鼠炎癥和疼痛有顯著抑制作用，對(duì)炎癥和疼痛有一定治療效果。

4 結(jié)論

4.1 歸芪益母口服液的抗菌效果

通過試驗(yàn)，證明歸芪益母口服液作用于大腸桿菌時(shí)抑菌圈不明顯，結(jié)果小于10.70 mm，抑菌效果較弱，最小抑菌、殺菌濃度為0.250 g/mL，殺菌活性較低。對(duì)沙門氏菌表現(xiàn)出較好抑菌效果，抑菌圈直徑為12.26 mm，最小抑菌濃度為0.125 g/mL，但殺菌效果較弱。

4.2 歸芪益母口服液的抗炎鎮(zhèn)痛效果

通過試驗(yàn)，證明歸芪益母口服液具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛效果。耳廓腫脹法中，腫脹抑制率有50.82%，熱板法中痛閾值明顯高于空白組，醋酸扭體法中抑制率有62.83%。