張偉建，袁杰斌，李 茂，趙佳偉，陸 培，安明哲，喬宗偉，趙 東

（宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644007）

苦蕎麥屬于雙子葉蓼科類植物，學(xué)名韃靼蕎麥?？嗍w麥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，包含碳水化合物、蛋白質(zhì)、多酚類、維生素、微量元素等?？嗍w麥中黃酮類物質(zhì)含量高，具有多種生理功能，有降低人體血脂與膽固醇、軟化血管、降血壓、降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化等功效，被譽(yù)為“藥食同源作物”，具有很高的醫(yī)療保健價(jià)值，且苦蕎麥中的黃酮類物質(zhì)含量要高于其他作物。

苦蕎麥作為營(yíng)養(yǎng)豐富的糧食品種非常適合用于釀酒，由于苦蕎中的黃酮類物質(zhì)具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以苦蕎黃酮是苦蕎酒中的標(biāo)志性成分。苦蕎酒中苦蕎黃酮的含量很低，往往需要通過(guò)外源添加苦蕎黃酮才能使其含量達(dá)到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，而苦蕎黃酮大多是從苦蕎麥籽粒中提取，這樣會(huì)造成糧食資源的浪費(fèi)。既然苦蕎酒中苦蕎黃酮的含量低，說(shuō)明苦蕎黃酮?dú)埩粼诟碑a(chǎn)物中，我國(guó)對(duì)副產(chǎn)物酒糟的利用除了用于飼料、菌類培養(yǎng)基質(zhì)外，大部分酒糟直接燃燒丟棄，而底鍋水經(jīng)處理后也會(huì)排放。因此，為了保護(hù)環(huán)境、合理利用資源、避免資源的浪費(fèi)，從苦蕎酒酒糟及底鍋水中提取苦蕎黃酮的研究具有很高的價(jià)值，目前，我國(guó)這方面的研究還較少。

超聲波輔助提取法利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，破壞原料細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，促進(jìn)天然活性物質(zhì)的析出。超聲波技術(shù)具有指向性好、能量大、穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)。目前超聲波輔助提取法已廣泛應(yīng)用到黃酮的提取中，王佰靈等采用超聲波輔助酶法提取金蕎麥總黃酮，并對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性的研究，田曉晶等采用超聲波輔助提取法和恒溫水浴提取法提取苦蕎黃酮，并得出超聲波提取法要優(yōu)于恒溫水浴提取法，Peng 等采用超聲波輔助法從苦蕎中提取了槲皮素、蘆丁和山奈酚3 種黃酮類物質(zhì)，并對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，提取率達(dá)到了3.94%。因此，本試驗(yàn)采取超聲波輔助乙醇提取法，主要研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)總黃酮提取的影響，利用正交試驗(yàn)探索超聲波輔助乙醇提取法提取苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物中總黃酮的最佳工藝條件，以期提高苦蕎酒釀造過(guò)程中副產(chǎn)物的利用，提高其附加價(jià)值，并為其綜合利用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：苦蕎麥?zhǔn)惺郏圃慵暗族佀疄楸竟咀灾啤?/p>

試劑：九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉（分析純），購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司；氫氧化鈉（分析純），購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；無(wú)水乙醇（色譜純），購(gòu)于SigmaAldrich（上海）公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁，購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

儀器設(shè)備：超聲清洗器，固特超聲；紫外分光光度計(jì)EVOLUTION 300，美國(guó)Thermo Fisher 公司；電子天平PB203-N，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司（METTLER TOLEDO）；培養(yǎng)箱/干燥箱PH-070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Mili-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

未經(jīng)蒸煮的苦蕎樣品：苦蕎麥經(jīng)水洗干凈后于60 ℃烘箱中烘干；經(jīng)蒸煮的苦蕎樣品：水洗后的苦蕎麥經(jīng)蒸煮后于60 ℃烘箱中烘干；酒糟樣品：蒸餾后的酒糟于60 ℃烘箱中烘干；酒糟+底鍋水樣品：蒸餾后將底鍋水與酒糟拌勻，于60 ℃烘箱中烘干。烘干后的樣品經(jīng)粉碎機(jī)打成粉狀備用。各樣品取0.8000 g，精確至0.0001 g，以60%乙醇水溶液為溶劑，料液比為1∶25，在45 ℃條件下超聲45 min，萃取完后過(guò)濾，并用60%乙醇水溶液洗滌濾渣，收集濾液，最后移至25 mL容量瓶中用60%乙醇水溶液定容至刻度。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 mg/mL），于10 mL 的比色管中，分別加3.0 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL、2.0 mL 無(wú)水乙醇，加入5 %亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，加入10 %硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，最后加入4 %氫氧化鈉溶液4 mL，用超純水定容混勻后放置15 min 即得反應(yīng)混合液。在508 nm 下，以空白樣（即標(biāo)曲的0點(diǎn)）為空白，測(cè)定出吸光值。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測(cè)定

吸取樣品提取液0.5 mL于10 mL比色管中，再加入2.7 mL無(wú)水乙醇，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，用超純水定容混勻后放置15 min 即得反應(yīng)混合液。在508 nm 下，以空白樣（即標(biāo)曲的0 點(diǎn)）為空白，測(cè)定出吸光值。

1.2.4 總黃酮含量的計(jì)算

式中：X——黃酮類化合物總含量，mg/g；

m——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的黃酮質(zhì)量，mg；

W——樣品的質(zhì)量，g；

d——稀釋倍數(shù)。

1.2.5 提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎酒糟及底鍋水總黃酮得率的影響

稱取5 份0.8000 g 酒糟及底鍋水樣品粉末，以固液比1∶25（g∶mL）分別與50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液混勻，在45 ℃下超聲45 min 后過(guò)濾，濾液移至25 mL 容量瓶中，分別以相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行試驗(yàn)。

1.2.5.2 萃取溫度對(duì)苦蕎酒糟及底鍋水總黃酮得率的影響

稱取5 份0.8000 g 酒糟及底鍋水樣品粉末，以固液比1∶25（g∶mL）與80%乙醇水溶液混勻，分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下超聲45 min 后過(guò)濾，濾液移至25 mL 容量瓶中，用80%的乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行試驗(yàn)。

1.2.5.3 萃取時(shí)間對(duì)苦蕎酒糟及底鍋水總黃酮得率的影響

稱取5 份0.8000 g 酒糟及底鍋水樣品粉末，以固液比1∶25（g∶mL）與80 %乙醇水溶液混勻，在45 ℃下分別超聲25 min、35 min、45 min、55 min、65 min 后過(guò)濾，濾液移至25 mL 容量瓶中，用80 %的乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行試驗(yàn)。

1.2.5.4 料液比對(duì)苦蕎酒糟及底鍋水總黃酮得率的影響

稱取5 份0.4000 g 酒糟及底鍋水樣品粉末，分別以固液比1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55（g∶mL）與80%乙醇水溶液混勻，在45 ℃下超聲45 min 后過(guò)濾，濾液移至25 mL 容量瓶中，用80%乙醇水溶液定容至刻度，做3次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用NaNO-Al(NO)比色法測(cè)定蘆丁含量，以蘆丁濃度為縱坐標(biāo)，OD為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0883x+0.0005，相關(guān)系數(shù)R=0.9998，說(shuō)明二者線性關(guān)系相當(dāng)好。

2.2 不同樣品間總黃酮含量的差異

從圖2 能清晰地看出，總黃酮含量從高到低分別為酒糟+底鍋水、酒糟、未經(jīng)蒸煮的苦蕎、蒸煮后的苦蕎。其中，酒糟和酒糟+底鍋水樣品中的總黃酮含量要遠(yuǎn)高于未經(jīng)蒸煮的苦蕎和蒸煮之后的苦蕎，酒糟中總黃酮含量是前兩者的1.6～1.9 倍，酒糟+底鍋水中總黃酮含量是前兩者的2.6～3.1 倍，這可能是因?yàn)樵诳嗍w酒發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)微生物代謝，使得苦蕎麥質(zhì)地變得松軟，更易與萃取劑結(jié)合，從而使得總黃酮含量增加。酒糟+底鍋水中的總黃酮含量要遠(yuǎn)高于酒糟中的黃酮，是酒糟中總黃酮含量的1.6 倍，可能是因?yàn)樵诰契恼麴s過(guò)程中，乙醇和水不斷被蒸餾后又冷凝下來(lái)，形成了類似回流的過(guò)程，使苦蕎中部分黃酮類物質(zhì)流失到甑桶的底部，從而導(dǎo)致底鍋水中含有大量的黃酮類物質(zhì)。通過(guò)分析未經(jīng)蒸煮的苦蕎和經(jīng)蒸煮之后的苦蕎樣品能進(jìn)一步證明，未經(jīng)蒸煮的苦蕎中總黃酮含量是蒸煮后苦蕎的1.1 倍，蒸煮過(guò)程中通過(guò)水的不斷蒸發(fā)與冷凝，使苦蕎中部分黃酮類物質(zhì)流失到鍋內(nèi)水中。由此判斷，應(yīng)該利用蒸酒之后的酒糟以及產(chǎn)生的底鍋水用來(lái)提取黃酮類物質(zhì)，不僅節(jié)省原料，同時(shí)增加了酒糟以及產(chǎn)生的廢水利用率。后續(xù)提取工藝的優(yōu)化均以酒糟+底鍋水混合樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

圖2 不同樣品間總黃酮含量

2.3 苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)小于80%時(shí)，總黃酮含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)總黃酮含量最高，達(dá)到41.25 mg/g；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80 %時(shí)，總黃酮含量隨之下降。由于乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%時(shí)提取的黃酮總含量差異較大，因此，后續(xù)做正交試驗(yàn)時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇75 %、80 %、85 %作為三個(gè)水平。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

2.3.2 萃取溫度對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

由圖4 可知，萃取溫度在35～45 ℃時(shí)，萃取出來(lái)的總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)萃取溫度為45 ℃時(shí)提取的總黃酮含量最高，達(dá)到43.60 mg/g；當(dāng)萃取溫度大于45 ℃時(shí)，總黃酮含量隨之降低。因此，后續(xù)做正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝時(shí)，萃取溫度選擇40 ℃、45 ℃和50 ℃作為三個(gè)水平。

圖4 萃取溫度對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

2.3.3 萃取時(shí)間對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

由圖5 可知，當(dāng)萃取時(shí)間小于45 min 時(shí)，總黃酮含量隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加，當(dāng)萃取時(shí)間為45 min 時(shí)，所提取的總黃酮含量達(dá)到最大值，達(dá)到了50.64 mg/g，隨后當(dāng)萃取時(shí)間再度延長(zhǎng)時(shí)，總黃酮含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢下降。因此，后續(xù)做正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝時(shí)，萃取時(shí)間選擇35 min、45 min和55 min作為三個(gè)水平。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

2.3.4 固液比對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

由圖6可知，當(dāng)固液比在1∶15～1∶45之間時(shí)，所提取的總黃酮含量隨固液比的增加而增加，總黃酮含量在固液比為1∶45時(shí)達(dá)到最大值，為48.92 mg/g。當(dāng)固液比再度增加時(shí)，總黃酮含量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，在后續(xù)做正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝時(shí)，固液比選擇1∶35、1∶45和1∶55作為三個(gè)水平。

圖6 固液比對(duì)苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物總黃酮含量的影響

2.4 酒糟和底鍋水混合物黃酮提取工藝正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1、表2）

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

由表2 可知，苦蕎酒酒糟及底鍋水總黃酮的最佳提取條件為ABCD，由極差值R 可知，各因素對(duì)苦蕎黃酮的影響次序?yàn)椋築（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（固液比）＞A（萃取時(shí)間）＞D（萃取溫度）。

表2 苦蕎酒酒糟及底鍋水混合物提取的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

3 結(jié)論

酒糟和底鍋水樣品中總黃酮含量要遠(yuǎn)高于酒糟、未經(jīng)蒸煮的苦蕎和蒸煮之后的苦蕎。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，超聲波輔助乙醇提取苦蕎酒酒糟及底鍋水中苦蕎黃酮的最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為85 %、萃取溫度為40 ℃、萃取時(shí)間55 min、固液比1∶45（g∶mL）。影響程度為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞固液比＞萃取時(shí)間＞萃取溫度。本文研究成果不僅對(duì)保護(hù)環(huán)境、合理利用資源有利，也為以后苦蕎黃酮的提取提供了參考。