王小平，王諾凡，陳小翔，王書奎

1南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院普通外科，江蘇 南京 210006；2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科，江蘇 南京 210029；3南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，4中心實驗室，江蘇 南京 210006

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的癌癥之一，每年約有120萬CRC新病例及60.87萬例CRC 患者死亡［1］。在美國，Ⅰ期CRC 患者的5 年生存率約為93.2%，而Ⅳ期患者僅為8.1%［2］。因此，CRC 的早期診斷對于提高總體生存率非常必要。盡管X 線鋇灌腸以及腸鏡檢查對CRC 的早期發(fā)現(xiàn)有一定臨床價值，但由于其成本較高及有創(chuàng)性，無法廣泛用于普查［3-4］。此外，目前使用的臨床腫瘤標志物，例如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）對于CRC 的早期診斷缺乏靈敏度和特異性［5］。因此尋求有效的高靈敏度及特異度的新型非侵入性生物標志物對于CRC 的早期篩查具有重要的臨床意義。

近年來，循環(huán)miRNA作為惡性腫瘤診斷的生物學標志物受到越來越多的關(guān)注。miRNA 是短的單鏈非編碼RNA（約22個核苷酸），可以通過結(jié)合靶基因mRNA 的3′UTR 誘導mRNA 降解或翻譯抑制，從而發(fā)揮生物學功能［6］。腫瘤細胞來源的循環(huán)miRNA穩(wěn)定存在于外周血中，它們不僅可以包裝成一些顆粒，如凋亡小體、外泌體，還可以與蛋白質(zhì)復合物結(jié)合，賦予它們抵抗內(nèi)源性核糖核酸酶活性、極端pH值及高溫的能力［7-9］。

本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE25609）分析CRC患者血清miR-23a 及miR-27a 的表達水平。通過回顧性分析100 例CRC 患者的臨床及隨訪資料，檢測CRC 患者血清miR-23a及miR-27a的表達水平，旨在探討其在CRC中的臨床價值，以期為CRC臨床診斷提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

收集2014 年1 月—2018 年12 月在南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院進行治療的100例CRC患者。同時收集100 例健康體檢者的血清作為對照組，血清立即保存至-80 ℃。結(jié)直腸癌的診斷以病理學診斷為金標準。所有接受過放化療等系統(tǒng)治療以及伴有其他部位腫瘤的患者均被排除。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清miRNA的檢測

所有血液樣本獲得后以1 500 r/min 的速度離心10 min，移液器收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。TRIzol LS（Invitrogen 公司，美國）試劑提取血清樣本中的總RNA，通過上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供的Hairpin-itTMmicroRNA and U6 snRNA normalization RT-PCR quantitation kit 檢測血清中miRNA的表達水平，以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCT計算血清中miRNA的相對表達量。

1.2.2 血清CEA的檢測

通過化學發(fā)光法檢測研究對象外周血標本分離后的血清CEA的水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（）表示。多組間比較采用方差分析。對照組和CRC組血清中miR-23a及miR-27a的表達水平采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料采用率表示，率的比較采用卡方檢驗；采用Logistic 回歸分析CRC 發(fā)生的影響因素，血清miR-23a、miR-27a及CEA對CRC的診斷效能分析使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-23a、miR-27a在CRC患者中高表達

Vychytilova-Faltejskova 等［10］通過二代測序發(fā)現(xiàn)miR-23a 以及miR-27a 可能作為CRC 早期診斷的標志物。本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE25609）對20 例健康體檢者和30 例CRC 患者血清進行表達水平分析，發(fā)現(xiàn)miR-23a和miR-27a在CRC患者血清中的表達水平顯著升高（P＜0.01，圖1），進而收集100 例CRC 患者及100 例健康體檢者血清，發(fā)現(xiàn)CRC 患者miR-23a及miR-27a的相對表達量明顯高于健康體檢者（P＜0.001，圖2）。

圖1 GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE25609）中血清miR-23a（A）、miR-27a（B）在CRC患者及健康體檢者中的表達水平Figure 1 The expression levels of serum miR-23a（A）and miR-27a（B）in patients with CRC and healthy subjects in GEO database（GSE25609）

圖2 100 例CRC 患者和健康體檢者中血清miR-23a（A）、miR-27a（B）的表達水平Figure 2 The expression levels of serum miR-23a（A）and miR-27a（B）in 100 CRC patients and healthy subjects

2.2 血清miR-23a、miR-27a與臨床病理特征的關(guān)系

為了進一步驗證血清miR-23a 及miR-27a 與臨床病理特征的關(guān)系，收集了上述CRC患者的臨床病理特征，繼而將100 例CRC 患者的血清miR-23a 及miR-27a的相對表達值由低到高排列，根據(jù)其中位表達值分成兩組（高表達組和低表達組），結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清miR-23a 及miR-27a 均與CRC 患者的T 分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（表1、2）。因此血清miR-23a 和miR-27a 的相對表達水平與CRC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

表1 血清miR-23a與CRC患者臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 Correlation between serum miR-23a expression and clinical characteristics in CRC patients［n（%）］

表2 血清miR-27a與CRC患者臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 Correlation between serum miR-27a expression and clinical characteristics in CRC patients［n（%）］

2.3 CRC發(fā)生影響因素的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析的結(jié)果顯示，年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙、飲酒與CRC 的發(fā)生無關(guān)（P＞0.05，表3）。血清CEA、miR-23a及miR-27a是影響CRC發(fā)生的危險因素（P均＜0.05，表3）。

表3 CRC發(fā)生影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果Table 3 Logistic regression analysis of influencing factors of CRC

2.4 血清miR-23a、miR-27a聯(lián)合CEA對CRC的診斷效率

CRC 患者血清CEA 的相對表達水平（24.56±5.4）ng/mL顯著高于健康體檢者（4.22±0.32）ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。血清CEA 診斷CRC的ROC 曲線下面積（AUC）為0.655（95% CI：0.576～0.734）（P＜0.001），靈敏度為50%，特異度為91%。血 清miR-23a 診 斷CRC 的AUC 為0.784（95% CI：0.721～0.847）（P＜0.001），靈敏度為62%，特異度為80%，miR-27a 的AUC 為0.802（95%CI：0.742～0.863）（P＜0.001），靈敏度為73%，特異度為82%。檢測miR-23a+miR-27a 時診斷CRC 的AUC 為0.890（95%CI：0.844～0.935）（P＜0.001），靈敏度為75%，特異度為91%。而血清miR-23a、miR-27a 聯(lián)合CEA 診斷CRC 的AUC 為0.921（95% CI：0.879～0.962）（P＜0.001），靈敏度為86%，特異度為94%（圖3）。因此，血清miR-23a、miR-27a 聯(lián)合CEA 的檢測對于CRC 的早期診斷具有重要價值。

圖3 血清miR-23a、miR-27a及CEA診斷CRC的ROC曲線Figure 3 ROC curve of serum miR-23a，miR-27a and CEA in the diagnosis of CRC

3 討論

CEA 一直以來被認為是CRC 輔助診斷的最常見生物學標志物，但CEA的升高經(jīng)常受到其他疾病的影響，特異度不高，對CRC的診斷缺乏特異性，對CRC的早期診斷價值有限。

miRNA 既可作為癌基因也可作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11-12］，研究報道，miRNA可以作為腫瘤診斷的生物標志物和預后因子，為腫瘤治療提供新策略。眾所周知，基于活檢的方法對于腫瘤患者的篩查和監(jiān)測具有侵襲性，且耗時較長。Mitchell等［7］研究表明腫瘤源性的miRNA能夠穩(wěn)定存在于人血清，該研究為miRNA在臨床上的應用開辟了一個非常廣闊的領(lǐng)域。

Lin 等［13］研究發(fā)現(xiàn)血清miR-34c 在食管癌患者中表達水平明顯升高，且可作為食管癌患者早期診斷的潛在標志物。Li 等［14］利用Exiqon miRNA qPCR panel 芯片以及qRT-PCR 的相對定量法發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清let-7b-5p、miR-122-5p、miR-146b-5p、miR-210-3p 及miR-215-5p的表達水平顯著高于健康體檢者，miRNA（let-7b-5p、miR-122-5p、miR-146b-5p、miR-210-3p 及miR-215-5p）聯(lián)合檢測可用于乳腺癌的早期診斷。上述研究表明血清miRNA的檢測有望成為腫瘤早期診斷的重要手段。

Deng等［15］研究發(fā)現(xiàn)miR-23a在CRC組織及細胞中顯著高表達，CRC 細胞中過表達miR-23a 可顯著促進CRC細胞生長。Barisciano 等［16］研究發(fā)現(xiàn)miR-27a 在CRC 組織及細胞中高表達，提示miR-23a 與CRC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫（GSE25609）對20例健康體檢者和30例CRC 患者血清中進行表達水平分析，發(fā)現(xiàn)miR-23a 和miR-27a在CRC 患者血清中表達水平顯著升高。進而收集CRC 患者及健康體檢者的血清進一步驗證miR-23a及miR-27a在CRC患者中的表達水平顯著高于健康體檢者。

盡管血清miR-23a 和miR-27a 有望作為CRC 早期診斷的生物標志物，但仍存在一些局限性。首先，本研究的樣本量相對較小，因此需要加大樣本量的前瞻性研究才能進一步闡明循環(huán)miR-23a 和miR-27a 作為CRC 新型診斷生物標志物的臨床價值。血清miR-23a 和miR-27a 在實驗期和驗證期的截斷值不同，造成這一現(xiàn)象的原因包括CRC的異質(zhì)性、樣本量的差異以及血細胞溶血等。

綜上所述，本研究證實血清miR-23a 和miR-27a在CRC患者中顯著升高，且二者表達水平與CRC患者的T 分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。血清miR-23a、miR-27a 聯(lián)合CEA 檢測可顯著提高CRC 診斷的AUC 及靈敏度。本研究有望為CRC的早期診斷提供生物學標志物，同時也為進一步研究CRC的分子生物學機制奠定基礎(chǔ)。