孫 峰，溫慧靈，宋國齊，曹 鑫，李俊宏，陸 偉，楊 力，劉 紅，姜勝華*

1南通大學附屬醫(yī)院血液病研究室，江蘇 南通 226001；2南通大學附屬海安醫(yī)院血液科，江蘇 南通 226600；3南通大學附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南通 226001

慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL），是一種以成熟小淋巴細胞在血液、骨髓、淋巴組織中慢性惡性增殖的疾病。其臨床特點為惡性增生的小淋巴細胞系單克隆、免疫不成熟型細胞。雖然大多數(shù)初治的CLL 患者屬于低危組，但其隨后疾病進展也表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。約10%CLL患者疾病進展迅速，很易錯失最佳治療時機，而有些CLL 患者可有數(shù)十年以上的無病進展期。低危CLL患者血清中β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β 2-MG）、可溶性CD23及胸苷激酶水平的升高往往提示存在疾病進展的高風險［1-3］。隨著熒光原位雜交技術(shù)（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）在染色體異常核型檢測中的應用，CLL 遺傳學的檢出率顯著提高，為60%～80%［4］。本研究目的為探討17p13缺失、11q23 缺失是否提示CLL 預后不佳，13q14 缺失是否提示疾病預后尚佳，CLL 患者分子遺傳學的異常是否在一定程度上指導了臨床靶向診療。

1 對象和方法

1.1 對象

74 例CLL 淋巴細胞白血病均為2013 年6 月—2020 年10 月在南通大學附屬醫(yī)院就診的門診或住院患者，其中男43 例，女31 例，年齡43～87 歲（中位年齡67.5歲）。其診斷根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、血象、骨髓象、免疫組化染色等測定結(jié)果并參照《中國慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤的診斷與治療指南》［5］。

1.2 方法

1.2.1 FISH檢查

CLL 患者應用D13S25（13q14.3）、RB1（13q14）、ATM（11q22.3）、p53（17p13）、CSP12 探針檢測分析。探針均購自北京金菩嘉醫(yī)療有限公司，操作方法按公司說明書進行。每例分析200 個細胞，計算出現(xiàn)陽性信號的百分率及其均值（z）和標準差（s），以z±3s 作為對比值，檢測值大于正常閾值為陽性。

1.2.2 資料質(zhì)量的保證

嚴格按照上述診斷標準診斷和收集CLL 患者，并由南通大學附屬醫(yī)院血液科副主任及以上醫(yī)師診斷，臨床指標［血紅蛋白、淋巴細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、β2-MG、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等］、骨髓涂片結(jié)果、免疫分型結(jié)果及FISH 結(jié)果均由檢驗技術(shù)人員嚴格按操作規(guī)程檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料采用卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗；生存分析采用極限乘積法（Kaplan Meier法）計算，行Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CLL患者的FISH結(jié)果

74例初診CLL患者中，F(xiàn)ISH檢查結(jié)果正常者為18例，占24.32%（18/74）；至少具有1種分子遺傳學異常者為56例，占75.68%（56/74）；del（13q）異常44例，占59.46%（44/74），其中D13S25（13q14.3）缺失32例，占43.24%（32/74）；RB1（13q14）缺 失12 例，占21.43%（12/74）；D13S25 和RB1 共同缺失12 例，占16.22%（12/74）。ATM基因缺失者僅6例，占10.71%（6/74）；P53基因缺失者8例，占10.81%（8/74）；12號染色體三體（+12）異常者14 例，占18.92%（14/74）（表1）。

表1 74例初診CLL患者的FISH結(jié)果Table 1 FISH results of 74 newly diagnosed CLL patients

2.2 CLL 患者FISH 檢測的分子遺傳學異常與臨床及實驗室檢查的關(guān)系

74例CLL患者遺傳學異常情況與患者性別、年齡無相關(guān)性（P＞0.05），與外周血淋巴細胞絕對值計數(shù)、血紅蛋白、血小板、β2-MG、LDH 的表達水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。Rai 分期中D13S25 基因缺失分布的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），主要分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，可能與本研究的病例均為初診患者有關(guān)。ATM基因缺失僅在高危組檢出，且此種分布差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，表2）。

表2 FISH檢測的遺傳學異常與臨床及實驗室檢查的關(guān)系Table 2 Relationship between genetic abnormalities detected by FISH and clinical and laboratory tests［n（%）］

2.3 74例CLL患者的生存分析

本研究對74例初診患者進行了隨訪，隨訪時間2013年6月1日—2020年10月30日，其中位生存期超過39.71個月。隨訪期間74例CLL患者中有9例患者死亡，其中5 例伴有P53 基因缺失或ATM 基因或復雜性核型異常，且均處于Binet分期C期、Rai改良分期的高危組。本研究發(fā)現(xiàn)低中危組的生存時間明顯優(yōu)于高危組（χ2=12.393，P＜0.001，圖1）；C期患者的生存時間明顯短于A期和B期患者（χ2=14.242，P=0.001，圖2）；伴有單純del（13q）核型異常的CLL患者生存時間明顯長于伴有其他核型異常、復雜核型的患者（χ2=8.138，P=0.017，圖3）；伴P53基因缺失CLL患者的平均生存時間為18.00個月，明顯短于不伴此種核型異常者（41.28 個月）；伴ATM 基因缺失者的平均生存時間為18.33 個月，明顯短于不伴此異常者（41.30 個月）。由于本研究中伴有P53 或ATM基因異常的發(fā)生率相對較低，其平均生存時間的差異是否有統(tǒng)計學意義，可能仍需擴大樣本量和延長隨訪時間繼續(xù)觀察。

圖1 低中危/高危組生存曲線Figure 1 Survival curve of low-moderate/high-risk groups

圖2 Binet分期各期生存曲線Figure 2 Survival curves of Binet stages

圖3 細胞遺傳學異常的生存曲線Figure 3 Survival curves for cytogenetic abnormalities

3 討論

本研究應用D13S25探針和RB1探針檢測13號染色體長臂的缺失、P53探針檢測17p13 缺失，ATM探針檢測11q22.3 缺失，CSP12 探針檢測12 號染色體三體。結(jié)果顯示，至少具有1 種分子遺傳學異常的發(fā)生率為75.68%，與國內(nèi)相關(guān)研究報道的63.3%～83.1%一致［6-7］，與國外相關(guān)報道的69%～82%也符合［4，8-10］。

本研究中del（13q）的發(fā)生率為59.46%，相近于Dohner 等［4］所報道的50%及國內(nèi)所報道的54%［6-7］，這一數(shù)據(jù)也說明del（13q）為CLL最常見的染色體異常。44例具有del（13q）的CLL患者在性別、年齡、臨床分期、淋巴細胞絕對值計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)、β2-MG、LDH 中的差異無統(tǒng)計學意義，隨訪期間，單純del（13q）核型異常的生存期明顯長于伴有其他核型異常、復雜核型的患者，這就提示單純del（13q）核型異常往往提示CLL的預后良好。

Dohner 等［4］認為ATM 基因缺失為CLL 第二常見的細胞遺傳學異常，發(fā)生率為10%～20%，且多發(fā)生于年輕CLL患者，伴有ATM 基因的缺失往往提示疾病進展迅速。本研究共有6 例患者伴有ATM 基因缺失，發(fā)生率為8.11%，發(fā)生率較低，可能與所搜集的樣本差異和地域差異有關(guān)。Binet 分期顯示，A期0 例，B期0例，C 期6例；Rai分期顯示，0期0例，Ⅰ期0 例，Ⅱ期0 例，Ⅲ期2 例，Ⅳ期4 例，ATM 基因缺失僅在Rai 改良分期的高危組中出現(xiàn)，在低中危組和高危組的分布差異具有統(tǒng)計學意義，表明ATM基因異常提示疾病進展較快。

P53 基因為重要的抑癌基因，位于染色體17q13，其缺失引起細胞周期和細胞凋亡失調(diào)，從而促進疾病的發(fā)生、進展。本研究中8 例檢出P53 基因缺失，發(fā)生率為10.81%，Binet 分期均處于C 期，Rai 分期均處于Ⅲ、Ⅳ期，疾病進展迅速，生存期較短，且伴P53 基因缺失CLL 患者的平均生存時間僅為18.00個月，明顯短于不伴此種核型異常者（41.28個月），但是否有統(tǒng)計學意義，需擴大樣本量及延長隨訪時間才能進一步明確，但存在這種差異，說明P53基因缺失可能提示預后不良。

本研究中12號染色體三體的發(fā)生率為18.92%，且5例伴有其他染色體異常，均伴有del（13）。臨床多見于Binet分期B和C期，且這種分期分布的差異具有統(tǒng)計學意義，這與相關(guān)文獻報道的12 號染色體三體多見于疾病晚期一致［11-12］。叢佳等［13］研究發(fā)現(xiàn)+12遺傳學異常在年齡較高組（≥60歲）中更易出現(xiàn)，本研究14例+12異常者，其中有12例≥60歲，2例＜60 例，但年齡分布差異沒有統(tǒng)計學意義。CD38是一個高度保守的跨膜糖蛋白，在血液和淋巴器官之間轉(zhuǎn)運淋巴細胞及淋巴器官產(chǎn)生和淋巴細胞增殖中發(fā)揮重要作用，因此CD38 抑制劑對部分CLL患者有特定療效，目前CD38 抑制劑正在研究開發(fā)中［14-17］。具有12 號染色體三體的CLL 患者往往具有高水平的CD20 表達，這就表明具有12 號染色體三體的CLL 患者可能對利妥昔單抗有更好的反應［18］，這些都為CLL 患者的治療策略提供了新思路，但其確切療效和應用價值還有待進一步研究和更多證據(jù)驗證。

CLL患者的預后有著明顯的異質(zhì)性。分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)染色體異常與患者的生存期密切相關(guān)，根據(jù)預后情況將分子遺傳學異常從預后差至預后相對好排序為17p13 缺失，其次是11q22.3 缺失，接著是12號染色體三體，具有最好預后的染色體異常是del（13q）［19］。CLL為惰性疾病，臨床表現(xiàn)各異，病程長短不一，預后差別較大，同一臨床分期，也可有截然不同的疾病進展和結(jié)局。傳統(tǒng)的CLL 預后指標有其局限性，隨著近年來分子檢測技術(shù)的發(fā)展和不斷深入，目前認為分子細胞遺傳標志是CLL 最具價值的預后指標，對于CLL 預后的意義優(yōu)于其他傳統(tǒng)預后指標，將FISH結(jié)果與臨床分期結(jié)合可更好地預測CLL患者的預后。