闞雪純，何潤(rùn)東，葛佳穎，吳 俊，苗登順

南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，江蘇 南京 211166

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)異常為特征的代謝性骨疾病，好發(fā)于中老年人群以及絕經(jīng)后婦女，可導(dǎo)致骨脆性增加，顯著提高骨折的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。近年來(lái)，隨著社會(huì)老齡化問(wèn)題的加重，骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率不斷提高，進(jìn)一步加重了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康［3］。

目前針對(duì)OP 的防治藥物主要包括骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑以及骨礦化物，如雙磷酸鹽類(lèi)、降鈣素、甲狀旁腺素等，但這些藥物只能改善患者臨床癥狀、延緩病情，并不能從根本上改善骨代謝情況，亦不能恢復(fù)成骨與破骨進(jìn)程的動(dòng)態(tài)平衡，并且存在一定的不良反應(yīng)［3-5］。

作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的主要治療方法，中醫(yī)根據(jù)臨床癥狀和體征將骨質(zhì)疏松歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇，其病因主要概括為腎精不足、脾胃虛弱、肝失條達(dá)和瘀血阻絡(luò)［6］。與西醫(yī)療法相比，中醫(yī)治療有單味中藥療法、復(fù)方制劑療法、針灸療法等，具有不良反應(yīng)小，療效顯著的優(yōu)勢(shì)，可為OP 的防治提供新的方向［7-8］。續(xù)斷，又名川斷、川續(xù)斷，為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷的干燥根，因能“續(xù)折接骨”而得名。性微溫，味苦、辛，歸肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的功效，臨床上常用于肝腎不足、腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、筋傷骨折、崩漏、胎漏等疾?。?］。已有研究證實(shí)，續(xù)斷可通過(guò)多種信號(hào)途徑參與骨形成與骨代謝過(guò)程［4，10-11］，其活性成分皂苷可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化從而能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化，因此有望用于OP的治療。

與化學(xué)藥物的藥理特征通常為單一成分相比，中藥尤其是復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)［12］，其作用機(jī)制也更為復(fù)雜。然而近年來(lái)生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)以及多重藥理學(xué)的發(fā)展，使明確中醫(yī)藥發(fā)揮療效的分子機(jī)制以及基于復(fù)雜的生物系統(tǒng)探索中草藥配方成為可能［13］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合多學(xué)科理論發(fā)展形成的一種新方法，它是在現(xiàn)代藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上提出的一種新的藥物設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)方法和策略。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)促進(jìn)了醫(yī)學(xué)研究從之前的“單一靶點(diǎn)、單一藥物”向“多靶點(diǎn)、多藥物”這一新模式的轉(zhuǎn)變，為新藥開(kāi)發(fā)提供了新途徑和新策略［14］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析續(xù)斷的有效活性成分、作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，同時(shí)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析的方法進(jìn)一步預(yù)測(cè)續(xù)斷抗OP 的靶點(diǎn)，并對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，探討續(xù)斷治療OP的潛在作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 資料

通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）［15］，以口服生物利用度（oral bio-availability，OB）≥30%、藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18［16］為指標(biāo)篩選續(xù)斷活性成分。同時(shí)采用TCMSP 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型對(duì)相關(guān)活性成分作用靶點(diǎn)。再將靶點(diǎn)在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)［17］中進(jìn)行搜索，選擇物種設(shè)置為人，對(duì)搜集篩選得到的靶點(diǎn)蛋白或基因信息進(jìn)行校正，獲得靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的Uniprot名稱(chēng)，將續(xù)斷每種活性成分的靶點(diǎn)集與疾病靶點(diǎn)集進(jìn)行映射取交集，得到續(xù)斷抗OP 的有效成分。

1.2 方法

1.2.1 OP相關(guān)靶基因的獲取以及中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)［18］和Dis-GeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)［19］）中分別以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索與OP相關(guān)的靶基因，獲得的基因集作為疾病靶點(diǎn)，并將其與續(xù)斷作用靶點(diǎn)在軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中取交集后獲得續(xù)斷-OP 疾病交集靶點(diǎn)。最后利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“續(xù)斷活性成分-靶蛋白-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)。選取節(jié)點(diǎn)度（Degree）大于中位數(shù)4 倍的靶蛋白，并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，得到中藥-成分-疾病-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 GO富集分析與KEGG通路分析

通過(guò)Enrichr 在線(xiàn)工具［20］進(jìn)行交集靶點(diǎn)的基因本體論（GO）分析以及KEGG通路富集分析，并對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2.3 中藥-疾病靶標(biāo)蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心

利用STRING在線(xiàn)軟件［21］將所得14個(gè)基因交集靶點(diǎn)輸入軟件，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分?jǐn)?shù)值為0.4，構(gòu)建續(xù)斷治療OP 的基因PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件中的插件Cytohubba，根據(jù)MCC、Degree、Betweenness等參數(shù)進(jìn)行分析，對(duì)得分前3位的基因取交集，確認(rèn)網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.2.4 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

根據(jù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)［22］找到核心靶點(diǎn)蛋白的PDB-ID，使用PyMOL 軟件刪除水分子和小分子配體，通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)［23］獲得調(diào)節(jié)核心靶點(diǎn)的分子活性成分結(jié)構(gòu)，使用ChemBio 3D繪制小分子的二維結(jié)構(gòu)，并將其保存為PDBQT 格式備用。將處理好的受體和配體分別保存為PDB 格式備用，并在AutoDock Vina 分子對(duì)接軟件下，對(duì)續(xù)斷活性成分和重要靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 續(xù)斷活性成分及其靶基因

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索有關(guān)續(xù)斷中所有已報(bào)道的成分，并且按OB≥30%和DL≥0.18 作為篩選續(xù)斷潛在活性成分的標(biāo)準(zhǔn)，共獲得續(xù)斷活性化合物8 個(gè)（表1）。接著利用相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)預(yù)測(cè)上述活性成分作用靶點(diǎn)53 個(gè)，再以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到4 273 和1 098 個(gè)相關(guān)疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)作為疾病靶點(diǎn)。將GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的相關(guān)化合物靶點(diǎn)與活性成分作用靶點(diǎn)取交集得到續(xù)斷作用靶點(diǎn)14個(gè)（圖1）。

表1 經(jīng)OB和DL篩選的續(xù)斷活性成分Table 1 Active ingredients of XuDuan screened by OB and DL

圖1 續(xù)斷作用靶點(diǎn)韋恩圖Figure 1 Venn diagram of XuDuan targets

2.2 中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

通過(guò)GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得OP 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并與續(xù)斷作用靶點(diǎn)取交集后獲得續(xù)斷-OP 疾病交集靶點(diǎn)14 個(gè)。然后，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2）。由圖可見(jiàn)續(xù)斷主要通過(guò)龍膽根素、β-谷甾醇、林生續(xù)斷苷Ⅲ_qt 以及（-）-3，5-二咖啡?？鼘幩岬? 種活性成分作用于14個(gè)靶標(biāo)基因影響OP的發(fā)生。

圖2 中藥-成分-疾病-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Regulation network of XuDuan-compounddisease-target

2.3 續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將疾病靶點(diǎn)與有效成分靶點(diǎn)通過(guò)韋恩圖取交集得到的14個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)基因?qū)隨tring在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，以綜合得分（combined score）＞0.4 為閾值，構(gòu)建得到續(xù)斷抗OP靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。

圖3 續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Network of XuDuan target genes on osteoporosis

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果

為了進(jìn)一步明確續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制，利用Enrichr 在線(xiàn)工具分析上述靶基因參與的主要信號(hào)通路。GO 分析結(jié)果顯示，上述交集靶點(diǎn)的生物過(guò)程主要包括參與調(diào)控蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中的定位、活性氧代謝、未折疊蛋白反應(yīng)等；細(xì)胞組分主要包括高爾基體腔、球形高密度脂蛋白顆粒以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；分子功能主要與芳香酯酶活性、羧酸酯水解酶活性和多巴胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等有關(guān)（圖4A～C）。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，差異蛋白主要富集在與催乳素信號(hào)通路、利什曼病、結(jié)腸直腸癌等相關(guān)的信號(hào)通路中（圖4D）。

圖4 GO富集分析和KEGG通路分析Figure 4 Enrichment analysis of GO and KEGG of XuDuan target genes on osteoporosis

2.5 分子對(duì)接

利用Cytoscape 軟件中的插Cytohubba，根據(jù)MCC、Degree、Betweenness 等參數(shù)對(duì)2.3 中獲得的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，對(duì)得分前3位的基因取交集，確認(rèn)MAPK14 和TGFB1 為網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。將MAPK14 和TGFB1 分別通過(guò)對(duì)接平臺(tái)AutoDock Vina 與續(xù)斷的活性成分Gentisin 和beta-sitosterol 進(jìn)行分子對(duì)接，分別獲得20 個(gè)模型，Gentisin 與MAPK14（最低結(jié)合能為-6.2 kcal/mol）、beta-sitosterol 與TGFB1（最低結(jié)合能為-9.0 kcal/mol）的分子對(duì)接結(jié)果顯示（圖5）。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大，結(jié)合能≤-5 kcal/mol 時(shí)則視為成分與靶點(diǎn)有較好的活性，結(jié)合能≤-7 kcal/mol 時(shí)則結(jié)合活性強(qiáng)烈［24］。本研究結(jié)果說(shuō)明續(xù)斷的活性成分和靶標(biāo)之間具有良好的結(jié)合能力。

圖5 分子對(duì)接模式圖Figure 5 Docking model of of Xu Duan active ingredient with the key target molecule

3 討論

OP是一種由多因素導(dǎo)致的代謝性疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量；目前臨床治療OP的藥物多為單一化合物的靶點(diǎn)治療，但僅能減輕OP的相關(guān)癥狀，且價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)較大，很難達(dá)到理想的治療效果。近年來(lái)，中草藥由于其本身具有的整體治療效果及具有不良反應(yīng)小、療效顯著、可長(zhǎng)期服用等特點(diǎn)，得到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分［25］可用于進(jìn)一步探究中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建了續(xù)斷-活性成分-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)及活性成分-靶蛋白-疾病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷的主要活性成分可通過(guò)多靶點(diǎn)、多基因影響OP的發(fā)生發(fā)展，可用于治療OP。

本研究證明續(xù)斷治療OP 的靶基因主要涉及MAPK14、TGFB1、NOS2、PTPN1、F2 等，這些基因可通過(guò)影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中的定位、活性氧代謝、未折疊蛋白反應(yīng)等生物過(guò)程，以及芳香酯酶、羧酸酯水解酶和多巴胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體等功能蛋白的活性，從基因水平調(diào)控OP的過(guò)程。同時(shí)，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷治療OP 的核心靶標(biāo)涉及的通路包括催乳素信號(hào)通路、利什曼病信號(hào)通路、結(jié)腸直腸癌信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥信號(hào)通路、肺結(jié)核信號(hào)通路等，它們分別從不同的生理學(xué)過(guò)程影響OP 的發(fā)生發(fā)展，使OP 與多種疾病產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。已有研究證實(shí)ESR1（ERα）被激活后可以抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖［26］，而在高雪等［27］的研究中指出甲狀腺素可作用于MAPK 通路，通過(guò)ER 促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖，由此可見(jiàn)MAPK 在骨質(zhì)疏松中的潛在作用。同樣，作為OP易感性的重要候選基因［28］，TGFB1 通過(guò)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及成骨細(xì)胞的增殖分化在OP的發(fā)生發(fā)展中作用巨大［29-30］。

利用Cytohubba 篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步的分子對(duì)接預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)續(xù)斷中的龍膽根素、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶蛋白MAPK14、TGFB1 體現(xiàn)出良好的分子對(duì)接活性，顯示本研究數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確，具有較高的可信度。

本研究在文獻(xiàn)檢索和活性成分篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)續(xù)斷抗OP 有效成分進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)續(xù)斷多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜作用機(jī)制進(jìn)行了研究，預(yù)測(cè)了續(xù)斷治療OP 的潛在靶點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制提供了參考。