劉易昕，何 強(qiáng)，張大鵬，嚴(yán) 坤，姚年偉，錢衛(wèi)慶

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210000

骨質(zhì)疏松是全世界范圍內(nèi)的健康難題，其發(fā)病與成骨、破骨代謝之間的失衡有關(guān)。促進(jìn)骨形成、探究其相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)防治骨質(zhì)疏松具有重大意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群，在體內(nèi)不同環(huán)境下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞，其分化去向在全身的骨代謝中起到了重要作用［1］，外部因素及其信號(hào)處理過(guò)程如何調(diào)控BMSC分化去向是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是高度結(jié)構(gòu)化的RNA轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸，不直接參與蛋白的翻譯過(guò)程［2］。起初認(rèn)為lncRNA 不具備生物學(xué)功能，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 可廣泛參與基因的表達(dá)調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，并與個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)［2］。研究表明，lncRNA 在基因水平對(duì)BMSC的調(diào)控起重要作用，參與BMSC 分化調(diào)控過(guò)程中復(fù)雜的信號(hào)通路，從而間接調(diào)控骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)生和發(fā)展［3-6］，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。本研究擬通過(guò)制備卵巢切除骨質(zhì)疏松模型，并培養(yǎng)骨質(zhì)疏松模型大鼠的BMSC，對(duì)細(xì)胞內(nèi)lncRNA 進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比研究相關(guān)差異lncRNA 基因的生物學(xué)功能及參與的相關(guān)信號(hào)通路，為后期進(jìn)一步的驗(yàn)證及功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取雌性SD 大鼠12 只，體重（250±10）g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)南京市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。12只SD大鼠分為對(duì)照組和骨質(zhì)疏松組，每組6 只。骨質(zhì)疏松組采用切除卵巢的方法制作模型，對(duì)照組僅采用腹部切開不作卵巢切除，均飼養(yǎng)3個(gè)月。3個(gè)月后每組取3只SD大鼠的BMSC用于基因芯片檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠卵巢切除骨質(zhì)疏松模型建立

根據(jù)文獻(xiàn)方法制作SD大鼠骨質(zhì)疏松模型［7］，采用10%水合氯醛以1 mL/250 g的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉滿意后大鼠腹部剪毛，采用碘伏進(jìn)行局部皮膚消毒，沿著腹部中線中下部正中作2 cm長(zhǎng)切口，將皮膚牽開，切開腹膜，進(jìn)入腹腔，沿雙側(cè)子宮外上角的輸卵管找到卵巢，絲線結(jié)扎卵巢蒂部，切除大鼠卵巢并取出，縫合腹膜和皮膚切口。對(duì)照組SD大鼠僅切開腹部后沿著輸卵管顯露卵巢，但不作卵巢切除，縫合腹膜及皮膚。

1.2.2 骨密度（bone mineral density，BMD）檢測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和飼養(yǎng)3 個(gè)月后分別檢測(cè)SD 大鼠的骨密度并進(jìn)行比較。采用10%水合氯醛以1 mL/250 g 劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉滿意后，將其四肢展開俯臥于雙能X 線吸收測(cè)量?jī)x（GE 公司，美國(guó)）平臺(tái)上，通過(guò)小動(dòng)物軟件測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定各組小鼠全身骨骼的骨密度。

1.2.3 BMSC的分離提取、培養(yǎng)及鑒定

飼養(yǎng)3個(gè)月后的SD大鼠，根據(jù)文獻(xiàn)介紹方法［8］，取大鼠右側(cè)股骨干，無(wú)菌條件下沿兩側(cè)干骺端剪斷，暴露骨髓腔，并以1 mL 無(wú)菌注射器吸取培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，直至流出的液體變?yōu)榍辶敛⑶夜堑念伾l(fā)白；用移液器將含有小鼠骨髓液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，輕柔吹打，去除殘?jiān)?，?jīng)離心、重懸后以1×106個(gè)/瓶的濃度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中，每隔2 d 更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合約80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代操作。選取第3代BMSC，常規(guī)消化并制備細(xì)胞懸液，1 000 r/min 室溫離心5 min 后PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)整濃度5×106個(gè)/mL加入流式細(xì)胞管，在避光條件下按說(shuō)明書每管分別加入熒光標(biāo)記的CD45、CD90抗體，4 ℃避光孵育1 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1 000 r/min 室溫離心5 min 后PBS 洗滌3次，將細(xì)胞重懸于加入約1 mL PBS緩沖液，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示CD45+細(xì)胞比例＜1%，而CD90+細(xì)胞比例＞95%。

1.2.4 基因芯片檢測(cè)差異lncRNA

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，取飼養(yǎng)3 個(gè)月后的骨質(zhì)疏松模型組大鼠3 只和對(duì)照組大鼠3 只，培養(yǎng)其BMSC，利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)BMSC內(nèi)差異lncRNA。

在Illumina TruSeq?RNA 樣品準(zhǔn)備試劑盒使用說(shuō)明書指導(dǎo)下進(jìn)行RNA提取及文庫(kù)的制備，最后進(jìn)行PCR 富集得到最終的cDNA 文庫(kù)。利用Trimmomatic（v0.32）進(jìn)行基因數(shù)據(jù)質(zhì)量過(guò)濾，保留基因質(zhì)量在20 以上的堿基?；虿町惐磉_(dá)的計(jì)量數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的readcount 數(shù)據(jù)。采用deseq進(jìn)行分析，采用Quantile的Normalization方法，選取P＜0.05、差異倍數(shù)＞2即|log2FC|＞1的基因作為差異表達(dá)的基因列出。

1.2.5 GO功能和KEGG信號(hào)通路富集度分析

通過(guò)GO 分類號(hào)和GO 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)分析工具將分類與具體基因聯(lián)系起來(lái)，對(duì)基因的功能進(jìn)行描述，通過(guò)分析明確差異基因主要參與的生物功能。對(duì)差異表達(dá)lncRNA 的共表達(dá)靶基因mRNA 做KEGG 信號(hào)通路富集分析，判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者信號(hào)通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨密度變化

所有12只大鼠均順利完成手術(shù)并飼養(yǎng)3個(gè)月。骨質(zhì)疏松模型組和對(duì)照組SD 大鼠術(shù)前骨密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（182.33±4.50）mg/cm2vs.（184.17±4.49）mg/cm2，P＞0.05］；骨質(zhì)疏松模型組SD 大鼠3 個(gè)月后骨密度為較對(duì)照組大鼠顯著降低［（157.33±6.28）mg/cm2vs.（183.33±4.50）mg/cm2，P＜0.05］，同時(shí)較切除卵巢前顯著降低（P＜0.05，圖1）。

圖1 SD大鼠骨密度檢測(cè)Figure 1 Bone mineral density of SD rats

2.2 大鼠BMSC內(nèi)lncRNA的差異表達(dá)

骨質(zhì)疏松模型組和對(duì)照組SD 大鼠BMSC 內(nèi)檢測(cè)出基因片段共計(jì)32 759 個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的有8 454個(gè)，其中上調(diào)3 593個(gè)，下調(diào)4 861個(gè)。檢測(cè)到的lncRNA基因片段共4 992個(gè)，按照|log2FC|＞1、P＜0.05 的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，骨質(zhì)疏松模型組和對(duì)照組大鼠BMSC 內(nèi)共116 個(gè)lncRNA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），占所有l(wèi)ncRNA 基因的2.3%，其中上調(diào)35個(gè)，下調(diào)81個(gè)。聚類熱圖和火山圖分析結(jié)果提示差異譜結(jié)果可靠（圖2）。

圖2 SD大鼠BMSC內(nèi)的lncRNA表達(dá)情況Figure 2 LncRNA expression in BMSC of SD rats

2.3 差異lncRNA高級(jí)分析結(jié)果

通過(guò)高級(jí)分析最終篩選出18個(gè)lncRNA差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其|log2FC|值均在6 以上，其中上調(diào)的基因數(shù)為3個(gè)，占總數(shù)的16.7%，下調(diào)的基因個(gè)數(shù)為15個(gè)，占總數(shù)的83.3%。通過(guò)“cis”調(diào)控機(jī)制來(lái)預(yù)測(cè)差異lncRNA 的靶基因4 532 個(gè)，上述|log2FC|值均在6 以上的18 個(gè)lncRNA 的預(yù)測(cè)下游mRNA基因見表1。

表1 表達(dá)顯著差異的lncRNA列表及預(yù)測(cè)的靶向基因Table 1 List of significantly differentially expressed lncRNA and predicted target genes

對(duì)基因芯片技術(shù)檢測(cè)到的差異基因、同時(shí)又被預(yù)測(cè)為差異lncRNA 可能調(diào)控靶標(biāo)的編碼基因，取交集共計(jì)273 個(gè)基因進(jìn)行GO 分析、KEGG 信號(hào)通路富集度分析（圖3）。根據(jù)GO 功能分析，生物學(xué)過(guò)程（BP）中基因分布前5 位的分別是發(fā)育過(guò)程（GO：0032502）、細(xì)胞生長(zhǎng)（GO：0001558），解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)育（GO：0048856）、刺激反應(yīng)（GO：0048583）和細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程（GO：0032268）。細(xì)胞成分（CC）方面，顯著差異lncRNA 主要存在于異染色質(zhì)、與膜相連的細(xì)胞器、核內(nèi)腔、激活素A復(fù)合體內(nèi)。

圖3 差異lncRNA相關(guān)分析Figure 3 Results of differential lncRNA advanced analysis

差異lncRNA 主要富集的KEGG 信號(hào)通路，前5 個(gè)信號(hào)通路分別是：蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)通路、味覺的傳導(dǎo)通路、核黃素的新陳代謝通路、泛酸鹽和輔酶A的生物合成通路與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)通路，這些通路可能間接調(diào)控骨質(zhì)疏松的病理生理過(guò)程。

3 討論

隨著社會(huì)老年化人口的增加，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來(lái)越高，其發(fā)病可以歸因于不平衡的成骨和破骨過(guò)程，但是其更詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。卵巢切除是制作骨質(zhì)疏松模型的方法之一［7］。通過(guò)對(duì)卵巢切除骨質(zhì)疏松模型與正常大鼠的骨密度結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，卵巢切除3 個(gè)月后，SD 大鼠的骨密度顯著降低，進(jìn)一步說(shuō)明骨質(zhì)疏松模型制作成功。

BMSC 是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等的前體干細(xì)胞，其向不同方向分化對(duì)成骨形成和破骨吸收平衡作用至關(guān)重要［1］。抑制BMSC成脂、破骨分化，促進(jìn)其成骨分化，糾正骨代謝失衡是治療骨質(zhì)疏松的研究方向之一［9-10］。在骨質(zhì)疏松的發(fā)病過(guò)程中，lncRNA 參與了細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)控，lncRNA在骨質(zhì)疏松中的具體作用機(jī)制尚不明確［11］。

lncRNA 對(duì)BMSC 的成骨分化發(fā)揮重要作用。通過(guò)對(duì)人BMSC 的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA ENST00000502125.2 可導(dǎo)致BMSC 內(nèi)的堿性磷酸酶染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，染色結(jié)節(jié)的數(shù)也顯著增多，表明細(xì)胞向成骨性細(xì)胞分化［5］。lncRNA H19在BMSC成骨分化過(guò)程中表達(dá)顯著，miR-140-5p表達(dá)顯著降低，功能分析顯示lncRNA H19過(guò)度表達(dá)可抑制miR-140-5p 表達(dá)，加速成骨BMSC 分化，而lncRNA H19缺失則抑制了BMSC 的成骨分化過(guò)程，lncRNA H19可調(diào)控BMSC 分化過(guò)程［3］。同樣，lncRNA MEG3 的下調(diào)能顯著抑制BMSC 的成骨能力，其過(guò)表達(dá)則能提高BMSC 的成骨能力，其對(duì)成骨分化的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP-4）來(lái)實(shí)現(xiàn)的［6］。

本研究中，在骨質(zhì)疏松模型大鼠BMSC 內(nèi)有116個(gè)lncRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，占所有l(wèi)ncRNA 基因的2.3%，其中上調(diào)的lncRNA 35 個(gè)，下調(diào)81個(gè)。根據(jù)GO功能分析，這些差異lncRNA主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育的調(diào)控、對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程的調(diào)控。差異lncRNA 主要富集的KEGG 信號(hào)通路包括蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)通路、味覺的傳導(dǎo)通路、核黃素的新陳代謝通路、泛酸鹽和輔酶A的生物合成通路與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)通路，這些通路可能間接調(diào)控骨質(zhì)疏松的病理過(guò)程，本研究結(jié)果可為后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等進(jìn)一步探索并驗(yàn)證lncRNA 對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)病的影響提供基礎(chǔ)。