孫林春，劉建璟，張 利

1南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，江蘇 南京 210008；2江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210009；3南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，4檢驗科，江蘇 南京 210009

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是致病因素引起的短時間內(nèi)腎臟功能急劇下降和/或腎實質(zhì)損傷，在臨床極為常見，在住院患者中的發(fā)生率為2%～12%，重癥監(jiān)護室患者可高達30%［1］。AKI 增加了腎臟病患者進展到終末期的風險，導致預后不良，尤其是同時發(fā)生腎功能下降和腎實質(zhì)損傷的患者［2］。引起AKI 的病因很多，如缺血-再灌注損傷、燒傷、藥物毒性、膿毒癥等，其中膿毒癥所致AKI 占臨床AKI的比例不斷增加，占到AKI病因的29.6%～47.6%［3］。AKI又能加重其他臟器損傷，引起多器官功能障礙。與非膿毒癥性AKI和單純膿毒癥患者相比，合并AKI的膿毒血癥患者預后明顯變差，病死率在50%～80%［4］。如何防治AKI 已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題，是腎臟病學及重癥醫(yī)學面臨的重要挑戰(zhàn)。

氧化應激是膿毒癥腎損傷的重要機制之一。線粒體是腎小管細胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源。膿毒癥時，腎組織受全身炎癥反應的影響，ROS 生成增多，最終引起膿毒癥腎損傷［5］。調(diào)節(jié)ROS 和氧化應激狀態(tài)可能成為膿毒癥腎損傷的潛在治療靶點。線粒體途徑是經(jīng)典的細胞凋亡信號通路。近來研究發(fā)現(xiàn)，ROS 爆發(fā)涉及線粒體途徑的細胞凋亡［6］。腫瘤細胞局部高濃度ROS 能引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，跨膜電位降低，細胞色素釋放并激活半胱氨酸蛋白酶Caspase，通過下游級聯(lián)反應導致DNA堿基斷裂，誘導凋亡［7］。但膿毒癥腎細胞損傷中氧化應激和Caspase途徑細胞凋亡的研究還較少。

模式識別分子通過模式識別受體作用于腎小管上皮細胞，誘導炎癥反應和組織細胞損傷。膿毒癥時，病原體相關(guān)分子模式被體內(nèi)的模式識別受體識別，引發(fā)炎癥反應；革蘭陰性細菌外膜的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是目前膿毒癥中研究最多的外源性模式識別分子［8］。H2O2能在短時間內(nèi)提高細胞中氧化應激水平，且涉及多種信號通路，被廣泛用于體外誘導氧化應激損傷的細胞模型［9］。本研究通過LPS 刺激建立人腎小管上皮細胞HK-2 的膿毒癥細胞模型，用H2O2和Caspase 3特異性肽類抑制劑Ac-DEVD-CHO 單獨或聯(lián)合干預細胞，觀察Caspase 依賴的氧化應激對腎小管上皮細胞損傷的調(diào)節(jié)作用，探討膿毒癥腎小管上皮損傷的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞HK-2細胞購自中科院典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

兔抗人Cleaved-Caspase 3 多克隆抗體、兔抗人Cleaved-PARP 多克隆抗體和兔抗人β-actin 多克隆抗體（ABI 公司，美國）；酶標羊抗兔IgG（南京建成生物工程研究所）；H2O2、Caspae 3抑制劑Ac-DEVDCHO（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；MTT 試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（BD 公司，美國）；DHE 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國），流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥細胞模型分組

用終濃度10 μg/mL 的LPS 處理12 h 建立膿毒癥細胞模型，分為：陰性對照組（不做處理）、過氧化氫組（H2O2300 μmol/L）、Caspase 抑制劑組（Ac-DEVD-CHO 15 μmol/L）、Caspase 抑制劑+過氧化氫組（H2O2300 μmol/L+Ac-DEVD-CHO 15 μmol/L），并以正常培養(yǎng)的HK-2細胞為空白對照組。

1.2.2 Western blot檢測

提取細胞總蛋白，用蛋白標準品繪制標準曲線進行蛋白定量。80 V恒壓電泳30 min后，繼續(xù)用120 V 恒壓電泳至蛋白Marker 跑至距離膠底1 cm，停止電泳。用硝酸纖維素薄膜90 V 恒壓下電轉(zhuǎn)2 h。將蛋白膜用封閉液（含5%脫脂奶粉）室溫封閉2 h，再浸入用封閉液按1∶500 稀釋的一抗溶液中，4 ℃過夜；將蛋白膜用TBST 洗滌3 次，5 min/次后，再浸入用TBST 按1∶1 000 稀釋的二抗溶液中，室溫孵育1 h。洗膜后，用顯影劑顯色，用自動凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP蛋白條帶。

1.2.3 ROS檢測

將各組細胞制成1×105個/mL 單細胞懸液，按100 μL/孔加入流式管中，加入5 μmol/L DHE，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌后，上流式細胞儀檢測。

1.2.4 細胞增殖檢測

將細胞按1×103個/孔接種到96孔板，給予相應處理，每組設(shè)6 個平行孔。分別在處理后的0 h 和48 h，每孔加入20 μL MTT溶液，置培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度，計算細胞存活率，以時間為橫坐標，存活率為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

1.2.5 細胞凋亡檢測

將各組細胞用胰酶消化后，用PBS 緩沖液制成1×105個/mL 單細胞懸液，按100 μL/孔加入流式管中，再分別加入20 μL Annexin V-異硫氰酸（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），和20 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）。另設(shè)單陽管和陰性對照管，室溫避光孵育20 min；再加入500 μL PBS 緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測。

1.2.6 細胞周期檢測

將各組細胞制成1×105個/mL 單細胞懸液，按100 μL/孔加入流式管中，加入1 mL PBS 和2 mL 無水乙醇，用封口膜密封管口置于4 ℃24 h，固定細胞。吸出上清液，加3 mL PBS重懸細胞，離心，向管底加入200 μL 50 mg/mL 的PI 染液，4 ℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2引起膿毒癥腎小管上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白的異常表達

H2O2組腎小管上皮細胞Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP 蛋白表達較陰性對照組顯著升高（P＜0.05）；兩組Cleaved-Caspase 3和Cleaved-PARP蛋白均高于空白對照組（P＜0.05，圖1）。結(jié)果表明，H2O2能引起膿毒癥腎小管上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白異常表達。

圖1 各組凋亡相關(guān)蛋白的表達Figure 1 Expression of apoptosis-related proteins in each group

2.2 Caspase 抑制劑降低氧化應激誘導的膿毒癥腎小管上皮細胞ROS水平

空白對照組、陰性對照組、H2O2組、Caspase 抑制劑組和Caspase 抑制劑+H2O2組細胞中ROS 平均熒光強度分別為783±67、1 216±92、1 915±122、1 112±85 和1 623±100。陰性對照組中ROS 水平較空白對照組細胞升高（P＜0.05）；H2O2組ROS 水平較陰性對照組進一步升高（P＜0.05），Caspase抑制劑+H2O2組細胞中ROS 水平較H2O2組降低（P＜0.05），但仍高于陰性對照組（P＜0.05，圖2）。結(jié)果說明，H2O2能提高膿毒癥腎小管上皮細胞的ROS 水平，而Caspase 抑制劑能降低H2O2誘導的ROS 水平升高效應。

圖2 各組細胞ROS水平檢測Figure 2 Detection of ROS levels in each group

2.3 Caspase 抑制劑削弱氧化應激對膿毒癥腎小管上皮細胞增殖的抑制作用

空白對照組、陰性對照組、H2O2組、Caspase 抑制劑組和Caspase 抑制劑+H2O2組細胞增殖率分別為（179.21±9.00）%、（153.57±7.40）%、（120.20±6.24）%、（159.21±8.25）%和（143.21±5.33）%。陰性對照組細胞增殖率低于空白對照組（P＜0.05），H2O2組細胞增殖率低于陰性對照組（P＜0.05），說明H2O2誘導的氧化應激能抑制膿毒癥腎小管上皮細胞增殖。Caspase 抑制劑+H2O2組細胞增殖率較H2O2組升高（P＜0.05），但仍低于陰性對照組（P＜0.05，圖3），說明Caspase 抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)氧化應激對細胞增殖的抑制效應。

圖3 各組細胞增殖水平檢測Figure 3 Detection of cell proliferation in each group

2.4 Caspase 抑制劑抑制氧化應激誘導的膿毒癥腎小管上皮細胞凋亡

由圖4可見，空白對照組、陰性對照組、H2O2組、Caspase 抑制劑組和Caspase 抑制劑+H2O2組的細胞凋亡率分別為（3.18±0.43）%、（6.25±0.40）%、（11.75±1.61）%、（5.01±0.78）%和（9.97±0.47）%。陰性對照組細胞凋亡率較空白對照組升高（P＜0.05），H2O2組細胞凋亡率較陰性對照組升高（P＜0.05）。Caspase 抑制劑+H2O2組細胞凋亡率較H2O2組降低（P＜0.05），仍高于陰性對照組（P＜0.05）。H2O2組細胞中Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP蛋白表達較陰性對照組升高（P＜0.05），Caspase抑制劑+H2O2組細胞中Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP 蛋白表達較H2O2組降低（P＜0.05，圖5）。結(jié)果顯示，H2O2能誘導膿毒癥腎小管上皮細胞凋亡，而Caspase 抑制劑能抑制H2O2誘導的細胞凋亡。

圖4 各組細胞凋亡檢測Figure 4 Detection of cell apoptosis in each group

圖5 各組凋亡相關(guān)蛋白的表達Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in each group of spesis

2.5 Caspase 抑制劑削弱氧化應激對膿毒癥腎小管上皮細胞周期的阻滯

由圖6 可見，空白對照組處于G1 期、G2 期和S期的細胞分別占（21.50±2.10）%、（32.63±2.76）%和（45.87±4.59）%。陰性對照組處于G1 期、G2 期和S期的細胞分別占（26.50±2.01）%、（27.63±3.34）%和（45.87±4.23）%。H2O2組處于G1 期、G2 期和S 期的細胞分別占（37.23±3.67）%、（15.39±2.10）%和（47.38±5.32）%。Caspase 抑制劑組處于G1 期、G2期和S 期的細胞分別占（28.67±3.87）%、（27.12 ±2.98）%和（44.20±5.10）%。Caspase 抑制劑+H2O2組處于G1 期、G2 期和S 期的細胞分別占（30.22±3.45）%、（21.01±3.44）%和（48.77±3.78）%。各組S期細胞比例無顯著差異（P＞0.05）。陰性對照組G1期細胞比例高于空白對照組（P＜0.05），H2O2組細胞G1 期比例高于陰性對照組（P＜0.05），說明H2O2誘導的氧化應激能引起膿毒癥細胞周期紊亂，發(fā)生G1期阻滯。Caspase 抑制劑+H2O2組細胞G1 期比例低于H2O2組（P＜0.05），說明Caspase 抑制劑能逆轉(zhuǎn)H2O2對細胞周期G1期的阻滯作用，促進周期進展。

圖6 各組細胞G1期比例Figure 6 Proportion of G1 phase cells in each group

3 討論

膿毒癥是宿主在應對感染時反應失調(diào)而引起的一種器官功能障礙綜合征，臨床上50%的膿毒癥患者均有不同程度的腎損害，并且與膿毒癥的2 年死亡率密切相關(guān)［10，11］。大多數(shù)膿毒癥患者死于多器官衰竭，AKI是最常見的并發(fā)癥之一，是膿毒癥患者死亡的獨立危險因素［2］，尋找膿毒癥急性腎損傷的特異性標志物和有效的防治策略刻不容緩。

氧化應激損傷是膿毒癥組織器官損傷的重要機制，且氧化應激和膿毒癥全身和局部持續(xù)性炎癥反應之間存在密切關(guān)聯(lián)。病原體及其釋放的毒素激活炎癥反應及宿主釋放炎癥介質(zhì)會影響氧化呼吸鏈的偶聯(lián)過程，引起線粒體損傷和功能障礙，最終導致組織、器官損傷。膿毒癥大鼠肺組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活性升高［12］。產(chǎn)生的大量iNOS 源性一氧化氮對心肌細胞也有毒性作用，能抑制心肌產(chǎn)生ATP，引起心肌收縮障礙，最終導致膿毒癥心力衰竭［13］。氧化應激也會對腎組織造成損傷，線粒體是腎實質(zhì)細胞ROS的主要產(chǎn)生部位［14］。生理條件下，腎實質(zhì)細胞中的ROS維持在較低水平，對腎小管和腎微循環(huán)的生理調(diào)節(jié)有作用［15］；膿毒癥時，在各種炎癥因子的刺激下，腎小管和腎血管中ROS 生成增強，同時谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化物減少，ROS 攻擊腎小管細胞導致膜損傷及線粒體超氧陰離子滲漏，隨著細胞中ROS 濃度的進一步增加，最終引起膿毒癥腎損傷［16］。以氧化應激損傷為靶點的治療已經(jīng)成為近年來膿毒癥的研究熱點。本研究發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激腎小管上皮細胞后，細胞ROS水平明顯較正常腎小管上皮細胞升高，提示膿毒癥時腎小管細胞的氧化應激水平較生理狀態(tài)異常升高。本研究用H2O2處理細胞，ROS檢測顯示H2O2引起了細胞更高水平的氧化應激損傷，結(jié)果顯示，與未經(jīng)H2O2處理的膿毒癥細胞模型相比，H2O2組細胞的增殖率降低，凋亡率升高，同時發(fā)生了細胞周期的G1期阻滯。結(jié)合文獻報告和本研究結(jié)果，我們更傾向于認為ROS 對膿毒癥腎小管上皮細胞有抑制增殖和周期進展，誘導凋亡的作用，這與文獻中以緩解氧化應激作為膿毒癥腎損傷治療的理論依據(jù)相吻合。

Caspase 是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，存在于胞質(zhì)中，線粒體途徑細胞凋亡的本質(zhì)是Caspase 依賴的蛋白酶級聯(lián)反應［17］。本研究重點關(guān)注的正是ROS 與線粒體途徑的細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞高表達Caspase-3/7，能破壞線粒體膜電位和上調(diào)ROS 水平，誘導細胞凋亡，ROS 抑制劑能逆轉(zhuǎn)這種效應［18］。原代大鼠軟骨細胞中過高水平的ROS能引起細胞色素c和Caspase-3高表達，促進細胞凋亡［19］。本研究用Caspase 抑制劑Ac-DEVD-CHO 聯(lián)合H2O2處理膿毒癥腎小管上皮細胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞ROS水平較H2O2組降低，但仍高于陰性對照組，說明H2O2誘導的氧化應激在一定程度上具有Caspase 依賴性，抑制Caspase 能部分減弱膿毒癥腎小管上皮的氧化應激損傷。細胞的相關(guān)生物學行為檢測顯示，Caspase抑制劑聯(lián)合H2O2處理的膿毒癥腎小管上皮細胞增殖率較H2O2組升高，凋亡率降低，細胞周期處于G1 期的比例減少，說明氧化應激損傷對膿毒癥腎小管細胞增殖、凋亡和細胞周期的作用具有Caspase 依賴性，抑制Caspase 能逆轉(zhuǎn)氧化應激損傷對膿毒癥腎小管細胞的抑制增殖、促進凋亡和引起細胞周期G1 期阻滯的效應。但是，Caspase 抑制劑聯(lián)合H2O2處理組的細胞增殖、凋亡和G1 期細胞周期所占比例仍和陰性對照組有差異，說明抑制Caspase 只能部分影響氧化應激對膿毒癥腎小管上皮的作用，提示氧化應激可能還通過其他途徑對膿毒癥腎小管上皮細胞造成損傷。Kaleem 等［20］研究顯示Caspase 釋放的功能受O2-調(diào)節(jié)，這與本研究結(jié)果相吻合。

綜合以上實驗結(jié)果，認為ROS造成的膿毒癥腎小管上皮細胞增殖抑制、凋亡增加和細胞周期G1期阻滯效應，部分是通過線粒體-Caspase 途徑實現(xiàn)的。通過直接降低ROS水平或阻斷線粒體-Caspase凋亡途徑，都能對膿毒癥時腎小管上皮細胞中異常升高的氧化應激水平產(chǎn)生抑制作用，并通過促進細胞的增殖和周期進展，減少細胞凋亡壞死，對腎小管上皮損傷起保護作用。但是除了線粒體-Caspase途徑，其他細胞凋亡通路是否也在膿毒癥腎小管損傷中發(fā)揮作用，目前尚不清楚，未來還需要更多的實驗進行探討。