朱曉晗，劉曉蕊，李 琳，王 盈，楊海元，戴一凡

南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點實驗室，江蘇 南京 211166

血友病乙（hemophilia B）是一種由缺乏凝血因子Ⅸ（factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸ）而引起的X 染色體隱性遺傳性出血性疾病，是最常見的先天性出血性疾病之一［1］。血友病乙在男性中的發(fā)病率較高，每10萬名男性中約有2.8例發(fā)生，無種族或地域差異性［2］。根據(jù)FⅨ在患者體內(nèi)的含量，血友病乙被分類為輕度（＞0.05～0.40 U/mL）、中度（0.01～0.05 U/mL）、重度（＜0.01 U/mL）3 個等級［1，3］。FⅨ又稱血漿凝血活酶，是一種維生素K 依賴性血漿蛋白酶，由肝臟合成，正常情況下在血漿中以無活性的酶原形式存在。人體內(nèi)FⅪa（activated factor Ⅺ，F(xiàn)Ⅺa）及FⅦa（activated factor Ⅶ，F(xiàn)Ⅶa）通過連續(xù)切割FⅨ的p.Arg191-Ala192和p.Arg226-Val227位點，從而使FⅨ活化。隨后，F(xiàn)Ⅸa（activated factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸa）與FⅧa（activated factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷa）形成FⅩ（factor Ⅹ，F(xiàn)Ⅹ）酶復(fù)合物，切割FⅩ的p.Arg182-Ser183 和p.Arg234-Ile235位點，使FⅩ活化，參與體內(nèi)凝血級聯(lián)反應(yīng)［4］。編碼FⅨ的基因F9 位于Xq27.1，全長約34 kb，由8個外顯子和7 個內(nèi)含子構(gòu)成，該基因的突變或缺失是血友病乙發(fā)病的根本原因［5］。截至2020年2月，F(xiàn)Ⅸ變異體數(shù)據(jù)庫（http：//www.factorix.org/）已統(tǒng)計血友病乙患者F9基因突變形式有1 244種，包括點突變、插入、缺失等，分布于內(nèi)含子、外顯子和非編碼區(qū)域，但最常見的突變發(fā)生在蛋白編碼區(qū)，且以點突變?yōu)橹鳎?-7］。

血友病乙作為一種基因病，針對其遺傳發(fā)病機制、基因診斷、基因治療的研究是當(dāng)前血友病乙研究的重點，但是這些研究需要有良好的動物模型。目前經(jīng)典的血友病動物模型有狗和小鼠，但兩者與人類親緣關(guān)系遠、生理特性不同，不能精準地模擬人類血友病的生理特性和臨床表征［8-9］。豬是除靈長動物以外與人類在進化上親緣關(guān)系最近的物種之一，在遺傳、生理生化和疾病發(fā)展等方面與人類具有極高的相似性，尤其是凝血系統(tǒng)與人類十分相似，因此是本次血友病乙動物模型構(gòu)建的良好選擇［10］。

本研究首先通過分析人和豬F9基因的同源性，以及對人和豬FⅨ二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的模擬和分析，驗證了人和豬FⅨ的高度同源性。其次以巴馬小型豬胎兒原代成纖維細胞（porcine fetal fibroblast，PFF）為原材料，結(jié)合CRISPR/Cas9 技術(shù)，構(gòu)建F9 基因第2 外顯子突變的單克隆細胞系，為進一步利用體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)構(gòu)建血友病乙豬模型提供了原材料。

1 材料和方法

1.1 材料

35 d原代巴馬豬胎兒成纖維細胞（PFF）由本組實驗室培養(yǎng)。DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒（北京天根生化科技公司）；pX330質(zhì)粒（Addgene 423230）、BbsⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 Ligase 連接酶（New England Biolabs 公司，美國）；Basic NucleofectorTMKits 和細胞電轉(zhuǎn)儀（Lonza 公司，德國）；DMEM 培養(yǎng)液，胎牛血清、胰酶、青鏈霉素雙抗和PBS 緩沖液（Gibco 公司，美國）；引物序列和磷酸化的寡核苷酸序列由南京金斯瑞公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人/豬F9基因同源性分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索包括人和豬在內(nèi)的多個物種的F9基因序列，利用MEGA X 軟件和在線工具iTOL（https：//itol.embl.de/）繪制系統(tǒng)進化樹。此外，搜索FⅨ的氨基酸序列，利用ClustalX2 軟件進行人和豬FⅨ氨基酸序列的比對，再用DNAman 軟件計算兩者氨基酸序列的相似值。

1.2.2 人/豬FⅨ蛋白的結(jié)構(gòu)比較

利用DNAstar軟件中的protein模塊分析人和豬FⅨ蛋白的二級結(jié)構(gòu)，使用Chou-Fasman算法預(yù)測人和豬FⅨ蛋白α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角的比例。使用Swiss Model在線工具（https：//www.swissmodel.expasy.org/）對人和豬FⅨ蛋白進行三維建模，然后利用pymol 軟件比較兩者三維結(jié)構(gòu)的相似度，得出均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值。

1.2.3 sgRNA的設(shè)計

依據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中豬的F9 基因序列，利用在線工具Primer3 web（http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計包含第2 外顯子在內(nèi)的1 kb 左右基因序列的PCR 引物exon-2，上游：5′-ACCAAAGCTGCTCTCCTGACTCA-3′，下游：5′-TGCTGGCGTAAACCTAGAGT-3′，使用巴馬豬PFF的基因組DNA作為模板進行擴增，反應(yīng)體系：50 μL，反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35個循環(huán)；72 ℃7 min；保存于4 ℃。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 產(chǎn)物長度，并送南京擎科公司進行測序，以確認巴馬豬F9基因第2外顯子序列與數(shù)據(jù)庫記載的符合程度。將測序獲得的巴馬豬F9 基因第2 外顯子序列作為模板，利用CRISPR 在線靶點設(shè)計工具（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html）設(shè)計2 對25 bp 左右的sgRNA 寡核苷酸序列，分別命名為2-sgRNA1、2-sgRNA2，5′末端磷酸化修飾，交由南京金斯瑞公司合成（表1）。

表1 F9基因靶向位點及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 F9 gene targeting loci and sgRNA oligonucleotide sequence

1.2.4 CRISPR/Cas9打靶載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9 打靶載體構(gòu)建主要包括：引物退火、pX330載體酶切、線性化pX330載體與sgRNA連接等步驟。首先，用高壓滅菌的去離子水分別將2對寡核苷酸單鏈稀釋成100 μmol/L 濃度，然后從正鏈引物與負鏈引物中各吸取1 μL，加入8 μL去離子水中。將混合好的10 μL 體系，在PCR 儀中進行退火操作：37 ℃30 min，95 ℃5 min；結(jié)束后以每分鐘降5 ℃的速度降至25 ℃保持。同時，按照說明書步驟，將pX330 載體用BbsⅠ酶進行酶切使其線性化，再分別將線性化的pX330載體與退火的雙鏈sgRNA用T4 Ligase 連接酶進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂板后挑取單菌落進行菌株保存和測序，根據(jù)返回的測序結(jié)果篩選包含正確打靶載體的菌株，將對應(yīng)菌株擴大培養(yǎng)后利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒進行質(zhì)粒提取。

1.2.5 細胞培養(yǎng)

原代巴馬豬PFF 用16%FBS 培養(yǎng)約24 h，條件為37 ℃，5%CO2。接著用DPBS清洗貼壁細胞，然后使用0.05%胰酶消化約2 min，終止消化后將細胞懸液收集到15 mL 離心管，1 200 r/min 離心5 min 得到細胞沉淀。按照Lonza成纖維細胞轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書配制核轉(zhuǎn)液，在核轉(zhuǎn)液中加入適量打靶載體及抗性質(zhì)粒（pHY54 SV40-neo），用核轉(zhuǎn)染程序U 023轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后用2～3 mL 16%FBS 培養(yǎng)液重懸細胞并分盤至20 個10 cm 培養(yǎng)皿中，使每個視野下的細胞數(shù)在50 個左右。細胞培養(yǎng)皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37 ℃，5%CO2［11］。

1.2.6 單細胞克隆的篩選與鑒定

細胞篩選：細胞培養(yǎng)24 h 后，用含有G418 藥物的培養(yǎng)液進行換液。藥物篩選第9 天左右，在4 倍鏡下觀察到單細胞克隆，挑選狀態(tài)佳的單細胞克隆，顯微鏡下觀察其位置，并于培養(yǎng)皿的皿底做標(biāo)記。去除皿中培養(yǎng)液，DPBS 清洗，在標(biāo)記處放置合適大小的克隆環(huán)，用0.25%的胰酶消化約2 min，加入無藥培養(yǎng)液中止消化，轉(zhuǎn)移細胞懸液至24 孔板，孔板蓋上標(biāo)記克隆編號和日期。24 孔板中的細胞隔日用含G418 的培養(yǎng)液進行換液，直至細胞長滿皿底，胰酶消化并傳代至12 孔板（遺留部分細胞在原皿），待12 孔板中的細胞長滿后，即可凍存?zhèn)溆?；遺留在24 孔板中的細胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，長滿皿底后提取基因組DNA，用于鑒定單細胞克隆基因型［12］。

單細胞克隆基因型的鑒定：用0.25%的胰蛋白酶消化24孔板里的細胞，用NP40裂解液裂解細胞，提取基因組DNA，用引物exon-2 進行PCR，反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃7 min；保存于4 ℃。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 產(chǎn)物長度，并將PCR 產(chǎn)物送南京擎科公司進行測序。測序結(jié)果返回后與野生型序列進行對比，得出每個單細胞克隆的基因型；根據(jù)結(jié)果去除12 孔板中的陰性號，保留陽性號，并進行凍存。

2 結(jié)果

2.1 人/豬F9基因同源性分析

利用MEGA X軟件和在線工具iTOL繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明人和豬F9基因遺傳距離較近（圖1）；利用ClustalX2軟件對人與豬FⅨ的氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示兩者FⅨ氨基酸序列高度一致（圖2）；接著用DNAman 軟件計算人與豬FⅨ氨基酸序列的相似值，結(jié)果為83.33%。以上結(jié)果表明人和豬FⅨ氨基酸序列具有很高的同源性。

圖1 不同物種F9基因系統(tǒng)進化樹Figure 1 Phylogenetic tree of F9 genes in different species

圖2 人/豬FⅨ蛋白氨基酸序列的同源性分析Figure 2 Homology analysis of amino acid sequence between human/pig FⅨprotein

2.2 人/豬FⅨ結(jié)構(gòu)的比較

利用DNAstar軟件中的protein模塊分析人和豬FⅨ的二級結(jié)構(gòu)，并使用Chou-Fasman 算法預(yù)測人和豬FⅨ的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角比例，結(jié)果顯示，人的FⅨα螺旋占26.9%，β折疊占35.8%，β轉(zhuǎn)角占33.8%（圖3A）；豬的FⅨα螺旋占21.2%，β折疊占32.9%，β轉(zhuǎn)角占35.5%（圖3B）。由此可見，人和豬FⅨ具有相似的二級結(jié)構(gòu)。使用Swiss Model 在線工具對人和豬FⅨ進行三維建模，接著利用pymol軟件比較兩者三維結(jié)構(gòu)的相似度，得出RMSD 值為0.149，表明兩者在三維結(jié)構(gòu)上亦具有極高的相似性（圖3C）。以上結(jié)果表明，人/豬FⅨ具有高度一致的同源性，因此可以推測人/豬FⅨ在對應(yīng)的組織內(nèi)具有相似的生理功能。

圖3 人/豬FⅨ蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析Figure 3 Analysis of FⅨprotein secondary and three-dimensional structures between human and pig

2.3 F9基因CRISPR/Cas9靶向載體的構(gòu)建

依據(jù)巴馬豬F9基因第2外顯子序列，利用在線工具設(shè)計2對sgRNA寡核苷酸序列（圖4A），退火形成雙鏈后分別與線性化pX330 載體連接（圖4B）。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂板后挑取單菌落進行搖菌，抽提質(zhì)粒并送測序，測序結(jié)果（圖4C、D）表明sgRNA均已成功連接至pX330上。

圖4 F9基因靶點和重組載體測序Figure 4 Targets of F9 gene and sequencing of recombinant vectors

2.4 單細胞克隆的獲得和鑒定

野生巴馬豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)染pX330-sgRNA 和抗性質(zhì)粒pHY54 SV40-neo 后，經(jīng)過G418篩選，最終得到單細胞克隆共55 個（表2），其中有25個單細胞克隆發(fā)生基因突變，敲除率為45.5%；選用敲除號中狀態(tài)較好的單細胞克隆進行凍存。

表2 F9敲除單細胞克隆基因型Table 2 Genotypes of F9 knockout single cell clones

3 討論

血友病乙是一種與X 染色體連鎖有關(guān)的隱性遺傳性凝血功能障礙，主要因F9 基因改變致血漿FⅨ活性缺乏［7］。大多數(shù)患者表現(xiàn)為自發(fā)性或輕微創(chuàng)傷后出血不止，以及長期反復(fù)出血導(dǎo)致的關(guān)節(jié)畸形和軀體殘疾等。中國血友病患病率為3.6/10 萬，其中，血友病乙所占比例為16.13%［13］。由于中國人口基數(shù)大，新增人口多，血友病乙仍是影響眾多家庭的遺傳疾病之一。目前血友病的治療方式包括輸注凝血因子制品、藥物輔助治療及正處于探索階段的基因治療術(shù)。疾病動物模型是研究血友病致病機制和治療策略的重要工具。因此，建立一個與人類血友病乙生物特性和臨床表征相近的動物模型顯得尤為重要［14-15］。

第1例血友病乙動物模型形成于二十世紀八十年代，美國Chapel Hill 鑒定出患有血友病乙的狗，其發(fā)病機制及臨床病理表現(xiàn)與人類血友病乙極為相似。二十世紀末，Monahan 等［16］提出將其用于血友病治療的臨床前動物試驗。基因工程技術(shù)推動了血友病乙動物模型的研究和應(yīng)用。1997 年，Lin等［17］利用胚胎干細胞基因打靶的方式獲得第一例血友病乙小鼠模型。二十一世紀以來，基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，基于DNA 雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）激活細胞內(nèi)部修復(fù)機制的工程化核酸酶基因編輯技術(shù)逐漸成為基因編輯技術(shù)的主流。2013年，Cong等［18］利用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)核酸酶（CRISPR/Cas9）技術(shù)在鼠和人類細胞中實現(xiàn)了基因編輯，開啟了基因編輯技術(shù)新篇章。此后，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建的血友病動物模型，尤其是多種小鼠血友病模型得到了極大的發(fā)展，為研究血友病提供了便利。

然而，小鼠與人類之間存在明顯的物種差異，并非構(gòu)建血友病動物模型的最佳選擇，深入研究血友病亟需一個與人類生理、病理情況更為相似的動物模型。豬在遺傳背景、生理特點及疾病發(fā)生發(fā)展等方面具有小鼠無法比擬的優(yōu)勢，且豬的凝血系統(tǒng)與人類極為相似，更符合血液病動物模型的需求。本研究通過分析人和豬F9的遺傳距離，以及對人和豬FⅨ氨基酸序列、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的模擬與分析，揭示了人與豬FⅨ的高度同源性。因此，豬是構(gòu)建血友病乙動物模型的良好選擇。此外，本課題組利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合體細胞核移植技術(shù)成功構(gòu)建了多個豬模型。2015 年Chen 等［19］構(gòu)建的3 只B 細胞缺陷仔豬；2018 年Zhang 等［12］構(gòu)建的GGTA1、CMAH 和β4GalNT2 三基因敲除豬；2019年Yao 等［20］構(gòu)建的聽力缺陷豬。以上成果表明了CRISPR/Cas9 技術(shù)在構(gòu)建基因修飾豬方面的可行性和便捷性。本研究利用2 個sgRNA 對巴馬小型豬的胎兒成纖維細胞的F9 基因進行打靶。CRISPR/Cas9 表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后經(jīng)過藥物篩選，獲得55 個單細胞克隆?；蛐头治鲲@示其中有25 個單細胞克隆在靶點處發(fā)生了基因突變［（包含15個大片段缺失（＞100 bp），8個小片段缺失（＜100 bp），5個堿基的插入，4 個堿基的突變］，敲除效率高達45.5%。本研究結(jié)果顯示在進行基因敲除時，在靶點處使用2個sgRNA是較為理想的選擇。

綜上，本研究通過高效的CRISPR/Cas9 打靶載體成功獲得了巴馬小型豬F9基因敲除細胞系，為接下來構(gòu)建血友病乙巴馬小型豬模型提供了重要的原材料。