沈 曄,錢芳波,司雯淼,袁文博,張 怡,徐 曄

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院計(jì)劃生育科，無錫 214000；2.浙江博圣生物技術(shù)股份有限公司，杭州 310012；3.新西蘭奧克蘭大學(xué)，奧克蘭 1142)

研究報(bào)道，女性發(fā)生1次自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)約為10%，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生率為1%～5%[1]。流產(chǎn)與染色體異常、免疫、易栓癥(血栓前狀態(tài))、內(nèi)分泌、感染、母體及環(huán)境等因素相關(guān)，其中約50%流產(chǎn)與染色體異常有關(guān)[2-3]。染色體異常主要包括數(shù)目異常(非整倍體、多倍體異常)、結(jié)構(gòu)畸變、嵌合體以及雜合性缺失等?？截悢?shù)變異(copy number variations,CNVs)是指染色體上大于1kb的DNA片段的增加或減少[4]，致病性CNVs可導(dǎo)致基因組病，從而引起流產(chǎn)、死胎、發(fā)育滯后、多發(fā)畸形等[5]。染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray analysis,CMA)在全基因組水平檢測(cè)染色體數(shù)目異常、CNVs、大多數(shù)的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)和一定水平的嵌合體，檢測(cè)范圍較廣。本研究對(duì)673例流產(chǎn)樣本進(jìn)行CMA檢測(cè)，探討CMA技術(shù)在流產(chǎn)或死胎遺傳學(xué)診斷的應(yīng)用價(jià)值及流產(chǎn)或死胎頻率和母體年齡與染色體異常的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年10月至2020年5月無錫市婦幼保健院就診的673例患者的流產(chǎn)樣本(568例流產(chǎn)絨毛、55例流產(chǎn)組織、49例引產(chǎn)羊水和1例引產(chǎn)臍血)，患者年齡22～45歲，孕周6～28周。本研究經(jīng)無錫市婦幼保健院倫理委員會(huì)審批通過，患者全部知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 采用組織提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取流產(chǎn)標(biāo)本基因組DNA，用CytoScan 750k(美國Affymetrix公司)單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP array)進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)基因組DNA酶切消化、PCR擴(kuò)增、磁珠純化、片段化、添加生物素標(biāo)記、芯片雜交、洗脫、染色和掃描，利用Chromosome Analysis Suite軟件及相關(guān)生物信息學(xué)方法比對(duì)GRCH37(hg19)分析原始數(shù)據(jù)，報(bào)告閾值為200kb以上的重復(fù)和100kb以上的缺失，不報(bào)告已知屬于正常多態(tài)的拷貝數(shù)變化。

2 結(jié) 果

2.1 染色體異常類型分布 673例樣本中有9例樣本存在嚴(yán)重的母血污染或DNA降解導(dǎo)致質(zhì)控不達(dá)標(biāo)，其余664例樣本檢測(cè)成功，檢測(cè)成功率為98.7%(664/673)。染色體正常276例(41.6%，276/664)，其中男性占53.6%(148/276)，女性占46.4%(128/276)，男女比例為1.16。染色體異常388例(41.6%，388/664)，包括非整倍體變異、整倍體變異、結(jié)構(gòu)異常、雜合性缺失(LOH)。非整倍體變異(含嵌合體)占比最大，共271例(40.8%，271/664)；整倍體變異48例(7.2%，48/664)；結(jié)構(gòu)變異75例(11.3%，75/664);LOH共11例(1.7%，11/664)。詳細(xì)的CMA結(jié)果匯總?cè)鐖D1。

圖1 染色體微陣列分析的結(jié)果匯總

2.2 染色體數(shù)目異常 本研究共發(fā)現(xiàn)271例(40.8%，271/664)非整倍體，包括260例單一染色體非整倍體和11例合并多個(gè)染色體的非整倍體。除染色體1、Y外，所有染色體都鑒定出了非整倍體。單一染色體非整倍體多為染色體三體(77.7%，202/260)，其余為染色體單體(22.3%，58/260)，其中1例21號(hào)染色體單體，1例嵌合型14號(hào)染色體單體，其余全部為X單體，即特納綜合癥(45,X)患者。在11例多重非整倍體的病例中，包括5例(2.2%)發(fā)生了兩個(gè)染色體三體，5例(1.8%)發(fā)生了三個(gè)染色體三體和1例49,XXXXY。染色體非整倍體異常分布見圖2。整倍體變異共檢出48例(7.2%,48/664)，全部為三倍體。

2.3 染色體結(jié)構(gòu)異常 本研究共檢出染色體結(jié)構(gòu)異常75例(11.3%,75/664)，片段大小在106.4kb至105.2Mb之間，其中25例(3.8%,25/664)存在≥10Mb的缺失或重復(fù)，50例(7.5%，50/664)存在<10Mb的微缺失或微重復(fù)。在染色體結(jié)構(gòu)異常的病例中，有31例CNV偏致病性的可能性大，占結(jié)構(gòu)異常的41.3%(31/75)。根據(jù)CNVs的大小和位置，建議對(duì)夫婦進(jìn)行進(jìn)一步相應(yīng)的遺傳學(xué)檢查。其中有24例病例做了相應(yīng)的父母驗(yàn)證(表1)，其中病例199的父親被確認(rèn)為相互平衡易位攜帶者，F(xiàn)ISH驗(yàn)證見圖3，該患者為1號(hào)染色體長臂末端片段與19號(hào)染色體短臂末端片段易位的攜帶者，另外6例CNV被確定遺傳自父母一人，其余病例的CNV來源均被認(rèn)為是新發(fā)。

圖2 首次流產(chǎn)和復(fù)發(fā)性(≥2)流產(chǎn)患者非整倍體中各染色體占比

圖3 病例199父源的FISH驗(yàn)證結(jié)果

表1 染色體結(jié)構(gòu)異常做父母驗(yàn)證的結(jié)果

2.4 純合區(qū)域 664例樣本中有11例(1.7%,11/664)出現(xiàn)了LOH(表2)，其中3例為全基因組UPD(uniparental disomy)，3例為單條染色體UPD，5例為區(qū)域性UPD。

2.5 流產(chǎn)次數(shù)和年齡與染色體異常的關(guān)系 將單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片結(jié)果分為首次流產(chǎn)(spontaneous abortion，SA)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)。本研究的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)定義為兩次或兩次以上的流產(chǎn)或胎停。SA組和RM組微陣列芯片的檢出率比較見表3。根據(jù)母親的年齡對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，染色體異常在高齡產(chǎn)婦(≥35歲)與低齡產(chǎn)婦(<35歲)的分布情況見表4。

表2 11例涉及雜合性缺失的結(jié)果

表3 流產(chǎn)次數(shù)與流產(chǎn)物染色體異常的關(guān)系

表4 母親年齡與流產(chǎn)物染色體異常的關(guān)系

3 討 論

本研究檢測(cè)成功的664例標(biāo)本中，染色體異常總檢出率為58.4%(388/664)，與之前研究報(bào)道的57.9%基本相符[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常占比最大的是非整倍體(40.8%)，證實(shí)了染色體非整倍體變異是引起臨床流產(chǎn)或死胎的最主要遺傳因素[7]。其次是染色體結(jié)構(gòu)異常(11.3%,75/664)，多倍體異常(7.2%,48/664)占染色體異常的第三大比例，染色體異常比例最小的為雜合性缺失(1.7%，11/664)。

本次研究的非整倍體和多倍體的頻率(40.8%和7.2%)與其他大規(guī)模研究的頻率(40%和7.5%)[6]相似。非整倍體異常中，16號(hào)染色體三體和特納綜合癥(45,X)數(shù)量最多，均為56例，分別占染色體數(shù)目異常的20.7%(56/271)，是最常見的非整倍體數(shù)目異常。其余異常主要集中在13、14、21、22三體，這與肖艷華等[8]報(bào)道基本一致。除染色體1、Y外，所有染色體都鑒定出了非整倍體。其中1號(hào)染色體占人類基因組全長的8%，發(fā)生數(shù)目異常將導(dǎo)致嚴(yán)重的胚胎畸形，基本在妊娠4周內(nèi)流產(chǎn)，故很難在流產(chǎn)物遺傳學(xué)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)[9]。染色體非整倍體胎兒形成主要原因是精子或卵子在減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體或姐妹染色單體不分離，當(dāng)這種異常的配子形成受精卵就會(huì)導(dǎo)致非整倍體異常的發(fā)生。對(duì)于流產(chǎn)物遺傳學(xué)檢測(cè)報(bào)告結(jié)果為13、14、15、21、22號(hào)染色體三體或單體時(shí)，一般建議其父母進(jìn)行染色體核型分析，以排除親本存在染色體羅氏易位的可能性[10]。據(jù)報(bào)道羅氏易位的人群攜帶率為1.23‰[11]，本次研究暫未發(fā)現(xiàn)羅氏易位的攜帶者。

CNVs是產(chǎn)前超聲異常、多發(fā)畸形、智力落后、發(fā)育遲緩的重要原因[12]，現(xiàn)也被認(rèn)為可能導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎。CNVs常表現(xiàn)為染色體的缺失和重復(fù)，通過基因劑量改變、染色體斷裂等方式影響基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生致病性變異，嚴(yán)重可導(dǎo)致流產(chǎn)或胎停。對(duì)于CNVs致病性的判讀，常需考慮CNVs所包含基因的數(shù)目、功能及非編碼區(qū)重要的調(diào)控元件等來判斷致病性等級(jí)，同時(shí)還需參考數(shù)據(jù)庫、正常人群中出現(xiàn)類似CNVs的頻率、變異來源等進(jìn)行綜合分析。根據(jù)2019年ClinGen/ACMG拷貝數(shù)變異解讀標(biāo)準(zhǔn)，將CNVs按五級(jí)分類系統(tǒng)進(jìn)行分類，分別為致病變異、疑似致病變異、臨床意義未明變異、疑似良性變異、良性變異。

本研究共檢出75例CNVs，片段大小106.4kb～105.2Mb，通過致病性判讀發(fā)現(xiàn)31例(4.7%，31/664)CNVs涉及大量功能基因，致病性可能性較高，19例(2.9%，19/664)疑似致病變異，23例(3.5%，23/664)臨床意義不明變異，2例(0.3%，2/664)疑似良性變異。不平衡易位被定義為一個(gè)染色體的末端存在缺失，同時(shí)另一個(gè)染色體的末端存在重復(fù)，本研究中有4例發(fā)生了不平衡易位。本研究中，可能來源于親本染色體平衡重排的染色體不平衡重排的頻率(0.6%，4/664)與之前的研究(0.6%，12/1861)[13]相似，其中1例經(jīng)FISH驗(yàn)證明確來源于父源的平衡易位。因此CNVs發(fā)生在染色體末端時(shí)，父母之一可能是該變異片段平衡易位的攜帶者，建議對(duì)夫婦進(jìn)行核型或FISH等相應(yīng)的遺傳學(xué)檢查；而對(duì)于非染色體末端的微缺失微重復(fù)，大多數(shù)為新發(fā)變異，少數(shù)遺傳自父母。

在這些CNVs中值得注意的是，1p36微缺失出現(xiàn)了5次(0.75%，5/664)，大小1.75Mb～9.21Mb，4例確定為新發(fā)變異，1例未知。1p36缺失綜合征缺失片段介于1p36.13～1p36.33，其發(fā)生率為1/5000～1/10000，此類患者一般具有不同程度的智力障礙、結(jié)構(gòu)性心臟缺陷、顏面部異常(如眼睛凹陷)及其他并發(fā)癥[14-15]。已有多篇文章對(duì)于產(chǎn)前和產(chǎn)后的1p36缺失進(jìn)行了報(bào)道[14,16]，但對(duì)于流產(chǎn)物遺傳學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1p36缺失的報(bào)道不多。本研究流產(chǎn)物遺傳學(xué)研究中1p36缺失出現(xiàn)了5次，因此，1p36缺失可能與流產(chǎn)或胎停有關(guān)。導(dǎo)致胚胎早期死亡的可能潛在機(jī)制是由1p36缺失導(dǎo)致的畸形胎兒心臟異常、腦發(fā)育異常有關(guān)，具體致病機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

此外，本次研究還檢測(cè)出11例(1.7%，11/664)LOH，與Wang等[6]研究的1.9%基本一致，高于用其他平臺(tái)檢測(cè)LOH檢出率為0.7%[17]，表明SNP-array可更好地檢出LOH。研究表明，接近3%染色體核型無異常的妊娠失敗與全基因組UPD相關(guān)[18]。由于技術(shù)的局限性，CMA只能檢測(cè)出等單親二倍體。目前已知母源的7、14和15號(hào)染色體及父源的6、11、14和15號(hào)染色體的UPD可導(dǎo)致臨床的異常表型，也有少數(shù)涉及母源的2、16和20號(hào)染色體及父源的20號(hào)染色體UPD表征異常的病例報(bào)道[19]，CMA可以通過父母的SNP微陣列結(jié)果對(duì)比確定親本起源。本研究中單一染色體UPD與區(qū)域性UPD是否攜帶有與遺傳印記(imprinting)相關(guān)的基因尚不完全清楚。該區(qū)域相關(guān)隱性致病基因變異的檢測(cè)有助于確認(rèn)是否有導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重結(jié)構(gòu)畸形甚至致死性基因。

對(duì)于LOH的解讀原則大致有四種：(1)血源同一，這是由于父母是遠(yuǎn)親關(guān)系，在基因組中常表現(xiàn)為小的LOH分散在少數(shù)幾條染色體上面；(2)近親關(guān)系，這是由于父母親緣關(guān)系較近，在基因組中表現(xiàn)為許多染色體上面有較大的LOH片段，這樣會(huì)增加隱性遺傳病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20]；(3)LOH發(fā)生在整條染色體或某一染色體部分區(qū)域，主要產(chǎn)生機(jī)制有受精后分裂錯(cuò)誤、配子互補(bǔ)、三體拯救及單體拯救等。依據(jù)不同的產(chǎn)生機(jī)制，可以形成完全性或嵌合性的整條或區(qū)段單親二倍體；(4)全基因組UPD，一般是由孤雌生殖或孤雄生殖引起的，全基因組UPD是無法正常發(fā)育，在早孕期自然流產(chǎn)，本研究檢出3例全基因組單親二倍體。

常規(guī)核型分析、基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)[21]、低深度高通量測(cè)序(copy number variation sequencing,CNV-seq)[10]等都無法檢測(cè)單親二倍體，而單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片不但可進(jìn)行染色體劑量的檢測(cè)，還能對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)，故其能檢出單親二倍體，體現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

目前，在國內(nèi)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)仍定義為同一夫妻發(fā)生3次或3次以上在妊娠28周之前的流產(chǎn)或胎停[22]。由于我國現(xiàn)階段生育年齡延遲、計(jì)劃生育政策改變，高齡孕婦越來越多，流產(chǎn)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)2次和3次者的病因構(gòu)成比相似[23]。近年來大多數(shù)專家認(rèn)為將連續(xù)兩次的自然流產(chǎn)定義為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。本研究中，比較了首次流產(chǎn)和2次及2次以上流產(chǎn)者的染色體異常發(fā)生頻率和分布，發(fā)現(xiàn)兩組間沒有顯著差異，這與Wang等[6]研究結(jié)果一致，提示染色體異常的頻率和分布與流產(chǎn)的頻率無關(guān)。因此，建議在臨床實(shí)踐中，無論是首次還是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，如需要查明流產(chǎn)原因,應(yīng)對(duì)妊娠產(chǎn)物標(biāo)本做CMA分析。

此外，本結(jié)果還顯示，高齡(≥35歲)產(chǎn)婦組染色體總異常的頻率明顯高于低齡(<35歲)產(chǎn)婦組，這與Wang等[6]研究結(jié)果一致。非整倍體發(fā)生頻率在高齡產(chǎn)婦組明顯高于年輕產(chǎn)婦組，而其他染色體異常的頻率在兩組間無顯著差異。表明胚胎非整倍體的發(fā)生率隨母體年齡的增加而增加，而多倍體、染色體結(jié)構(gòu)異常和UPD的發(fā)生率似乎與母體年齡無關(guān)。

綜上所述，SNP微陣列芯片是一種可靠、快速、高分辨率、全基因組水平的臨床妊娠流產(chǎn)的染色體檢測(cè)方法。SNP微陣列芯片可以同時(shí)檢測(cè)非整倍體、多倍體、亞顯微觀結(jié)構(gòu)的染色體拷貝數(shù)變異以及LOH，提高了流產(chǎn)物遺傳學(xué)檢測(cè)中染色體異常的檢出率?？傊琒NP微陣列分析是確定流產(chǎn)遺傳病因的一種有價(jià)值的方法。