孫彩萍，張 丹，張 珂

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 a.產(chǎn)科；b.生殖中心，鄭州 450014)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)以月經(jīng)稀發(fā)、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕卣鳎绊懭?%～20%的育齡婦女[1-2]。PCOS會(huì)增加2型糖尿病、妊娠糖尿病、其他妊娠相關(guān)并發(fā)癥、心腦血管事件、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)、卵巢惡性腫瘤等的風(fēng)險(xiǎn)[3]。顆粒細(xì)胞(granular cells,GC)是卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞周圍的體細(xì)胞，對(duì)卵泡發(fā)生至關(guān)重要，在PCOS、卵巢早衰等卵巢疾病中均發(fā)現(xiàn)了GC的病理變化[4]。據(jù)報(bào)道，GC暴露于高水平雄激素下，相當(dāng)于在PCOS中發(fā)現(xiàn)的雄激素，可導(dǎo)致卵泡進(jìn)展停滯[5]。在小鼠PCOS模型中觀察到卵泡數(shù)量增加和GC增殖[6]。此外，在PCOS女性卵巢中也觀察到小卵泡中GC增殖上調(diào)[7-8]。因此，卵巢GC異常增殖可能在PCOS的發(fā)病機(jī)制中起作用，但其潛在機(jī)制仍不清楚。

Claudin-6(CLDN6)是緊密連接蛋白的一個(gè)組成部分，在幾種類型的胚胎上皮細(xì)胞中表達(dá)，如小鼠胚胎干細(xì)胞、早期發(fā)育的上皮系細(xì)胞；在生殖細(xì)胞腫瘤中也高度表達(dá)，包括精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、成熟畸胎瘤和典型精原細(xì)胞瘤，但在正常成人細(xì)胞中的表達(dá)不多[9]。CLDN6表達(dá)和分布在腫瘤組織中的失調(diào)與癌癥進(jìn)展相關(guān)。研究顯示，在EC中CLDN6呈高表達(dá)，是EC患者的預(yù)后標(biāo)記物，也是一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)[10]；并且CLDN6在卵巢小細(xì)胞癌中也過度表達(dá)[11]。干擾CLDN6可抑制癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]；且CLDN6主要通過細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1)-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞行為[13]。

MAPK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號(hào)通路在PCOS的GC病理生理學(xué)中具有重要作用。ERK1/2可被排卵前卵泡GC中的LH激活，ERK1/2的不適當(dāng)激活可能會(huì)破壞正常的卵泡發(fā)育，且ERK1/2磷酸化增加會(huì)誘導(dǎo)GC增殖和遷移[14]。此外，有研究證實(shí)MAPK/ERK信號(hào)通路的異常激活可使GC增殖，導(dǎo)致異常卵泡生成和卵巢雄激素生成過多[15]。而CLDN6在PCOS中的表達(dá)，目前未見相關(guān)研究，MAPK/ERK信號(hào)通路的異常激活對(duì)GC增殖的影響是否與CLDN6表達(dá)有關(guān)還未可知。本研究旨在探討CLDN6在PCOS中的表達(dá)及其對(duì)卵巢GC增殖與凋亡的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠20只，3周齡，體質(zhì)量(50±5)g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司桐鄉(xiāng)分公司，生產(chǎn)許可證為SCXK(浙)2020-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度(20±2)℃、濕度(50±5)%、12h光照/12h黑暗周期的環(huán)境中，自由攝食和攝水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并獲得鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑 脫氫表雄酮(dehydroepian drosterone,DHEA)購自上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)B73856，純度≥98%；PD98059(ERK1/2信號(hào)通路抑制劑)購自MedChemExpress，貨號(hào)HY-12028，純度99.94%；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒(C0038)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062L)、細(xì)胞裂解液(P0013)、BCA試劑盒(P0010S)均購自碧云天生物科技有限公司；小干擾RNA(siRNA)CLDN6(si-CLDN6)和其陰性對(duì)照(si-NC)、pcDNA3.1-CLDN6和pcDNA3.1空載體質(zhì)粒(pcDNA3.1-NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma公司設(shè)計(jì)合成；Lipofectamine 2000(11668019)購自美國Thermo Fisher Scientific；TRIzol試劑(9108-1)、PrimeScriptTMRT試劑盒(RR037A)、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒(RR820A)均購自日本Takara公司；小鼠抗大鼠CLDN6抗體(sc-393671)、山羊抗小鼠IgG二抗(sc-525409)購自Santa Cruz Biotechnology；卵泡刺激素受體(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)抗體(ab75200)、ERK1/2(ab17942)、p-ERK1/2(ab278538)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(ab16663)、Bcl-2(ab196495)、Bax(ab32503)、Cleaved Caspases-3(ab184787)、GAPDH(ab9485)及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000分光光度計(jì)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；IX73倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；ABI Prism? 7300型熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、FACSCanto II流式細(xì)胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 模型的建立 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余大鼠連續(xù)21天皮下注射DHEA(6mg/100g，溶于0.2mL豆油)構(gòu)建PCOS模型(PCOS模型組)，正常對(duì)照組大鼠皮下注射0.2mL豆油。從第16天開始連續(xù)4天觀察陰道涂片，連續(xù)出現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞為造模成功[16]。注射DHEA第21d，禁食12h后稱重，在超凈工作臺(tái)上無菌環(huán)境下摘取大鼠卵巢組織，備用。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot檢測卵巢組織中CLDN6表達(dá) 使用Trizol試劑從組織中提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定濃度，使用PrimeScriptTMRT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系(25μL)：cDNA(200ng/μL)0.5μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL，上下游引物(表1)各1μL，ddH2O 10μL。擴(kuò)增條件：94℃變性2min，94℃ 30s、50～60℃ 30s、72℃ 30s共40個(gè)循環(huán)。用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，應(yīng)用2-ΔΔCt計(jì)算CLDN6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。取部分卵巢組織在RIPA裂解液中裂解，Western blot法檢測卵巢組織中CLDN6蛋白表達(dá)。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.3 卵巢GC的分離培養(yǎng)與鑒定 用生理鹽水沖洗大鼠卵巢組織，解剖顯微鏡下去除輸卵管和脂肪，置于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺)，用25號(hào)針頭穿刺竇卵泡釋放GC，使其懸浮在培養(yǎng)基中，用100μm細(xì)胞過濾器過濾純化，將GC重懸，40μm細(xì)胞過濾器過濾。200×g離心5min,將分離的GC洗滌兩次，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后，除去未貼壁細(xì)胞，每2d更換1次培養(yǎng)基。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。GC的鑒定：采用免疫細(xì)胞化法用FSHR(卵巢GC的特定標(biāo)記物)表達(dá)染色鑒定GC是一種簡便快速的方法。制作細(xì)胞爬片，24h后將爬片取出，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，3%過氧化氫孵育15min，正常山羊血清封閉20min，滴加兔抗大鼠FSHR一抗(1∶200)，4℃孵育過夜，PBS清洗，加山羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 分組與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期GC，按2×105細(xì)胞/孔接種于6孔板，將正常對(duì)照組大鼠的卵巢GC設(shè)為空白組，PCOS模型大鼠卵巢GC分為對(duì)照組(正常培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、si-NC組(轉(zhuǎn)染50nmol/L無干擾作用的si-CLDN6陰性對(duì)照siRNA)、si-CLDN6組(轉(zhuǎn)染50nmol/L靶向抑制CLDN6的特異性si-CLDN6)、pcDNA3.1-NC組(轉(zhuǎn)染50nmol/L pcDNA3.1-CLDN6陰性對(duì)照空載體質(zhì)粒)、pcDNA3.1-CLDN6組(轉(zhuǎn)染50nmol/L pcDNA3.1-CLDN6載體質(zhì)粒)、PD98059組(給予20μmol/L的PD98059處理)、pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組(在轉(zhuǎn)染前6h給予20μmol/L的PD98059處理GC，然后再轉(zhuǎn)染50nmol/L pcDNA3.1-CLDN6載體質(zhì)粒)，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，參照Lipofectamine 2000說明書步驟操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。RT-qPCR檢測細(xì)胞中CLDN6 mRNA表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果；轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR步驟同1.4.2。

1.4.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將GC按1×104細(xì)胞/孔接種到96孔板，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，按1.4.4步驟進(jìn)行分組和處理，培養(yǎng)48h，加10μL/孔CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h。使用酶標(biāo)儀檢測450nm波長下各孔吸光度值(optical density，OD)。

1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將GC以1×105細(xì)胞/孔接種在6孔板，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，按1.4.4的步驟進(jìn)行分組和處理，48h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，冷PBS洗滌2～3次，重懸細(xì)胞，使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒在室溫下用FITC-Annexin V和PI各5μL染色15min。使用流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡細(xì)胞。

1.4.7 Western blot法檢測細(xì)胞CLDN6、MAPK/ERK通路和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將GC置于含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行裂解。使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜用5%脫脂牛奶封閉1h，將膜與一抗(CLDN6、ERK1/2、p-ERK1/2、Cyclin D1、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2按1∶500稀釋，GAPDH按1∶1000稀釋)4℃孵育過夜。將膜進(jìn)一步與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶4000)室溫孵育1h，ECL顯色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件定量條帶強(qiáng)度。GAPDH為內(nèi)參，分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 CLDN6在大鼠卵巢組織中的表達(dá) RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，PCOS模型組大鼠卵巢組織中CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 大鼠卵巢組織CLDN6蛋白表達(dá)

表2 大鼠卵巢組織CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)

2.2 卵巢GC的鑒定 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，GC逐漸出現(xiàn)紡錘體形態(tài)(圖2A、B)；免疫細(xì)胞化法檢測結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，PCOS模型組大鼠的卵巢GC中FSHR陽性表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)(圖2C、D)。

圖2 大鼠卵巢GC的培養(yǎng)與鑒定A、B:分別為培養(yǎng)1d、3d的GC形態(tài)(100×);C、D:分別為正常對(duì)照組、PCOS模型組GC FSH的表達(dá)(400×)

2.3 各組卵巢GC中CLDN6表達(dá) 與空白組相比，對(duì)照組GC中CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組相比，si-CLDN6組GC中CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6組GC中CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與PD98059組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC中CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組卵巢GC中CLDN6蛋白表達(dá)A:空白組;B:對(duì)照組;C:si-NC組;D:si-CLDN6組;E:pcDNA3.1-NC組;F:pcDNA3.1-CLDN6組;G:PD98059組;H:pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組

2.4 干擾CLDN6表達(dá)對(duì)卵巢GC活性和凋亡的影響 與空白組相比，對(duì)照組GC活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，si-CLDN6組和PD98059組GC活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6組GC活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-CLDN6組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC活性顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)；與PD98059組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC活性顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表4。

表3 各組卵巢GC中CLDN6的表達(dá)

表4 干擾CLDN6的表達(dá)對(duì)卵巢GC活性和凋亡的影響

2.5 干擾CLDN6表達(dá)對(duì)卵巢GC增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，對(duì)照組GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，si-CLDN6組和PD98059組GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6組GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-CLDN6組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與PD98059組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；見圖4、表5。

圖4 干擾CLDN6的表達(dá)對(duì)卵巢GC增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A:空白組;B:對(duì)照組;C:si-NC組;D:si-CLDN6組;E:pcDNA3.1-NC組;F:pcDNA3.1-CLDN6組;G:PD98059組;H:pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組

表5 干擾CLDN6的表達(dá)對(duì)卵巢GC增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6 干擾CLDN6表達(dá)對(duì)卵巢GC中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，對(duì)照組GC中p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組相比，si-CLDN6組和PD98059組GC中p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，pcDNA3.1-CLDN6組GC中p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與pcDNA3.1-CLDN6組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC中p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與PD98059組相比，pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組GC中p-ERK1/2蛋白顯著升高(P<0.05)。見圖5、表6。

圖5 干擾CLDN6的表達(dá)對(duì)卵巢GC中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響A:空白組;B:對(duì)照組;C:si-NC組;D:si-CLDN6組;E:pcDNA3.1-NC組;F:pcDNA3.1-CLDN6組;G:PD98059組;H:pcDNA3.1-CLDN6+PD98059組

表6 干擾CLDN6表達(dá)對(duì)卵巢GC中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

GC為卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟提供了合適的微環(huán)境。為了響應(yīng)垂體促性腺激素分泌，GC上調(diào)多種基因的表達(dá)，這些基因編碼參與雄激素生物合成的類固醇生成途徑和代謝途徑的成分[17]。最近研究表明，在患有PCOS的女性中，GC異常增殖，并與卵巢內(nèi)雄激素的過量產(chǎn)生有關(guān)[5-8]。另有研究顯示，PCOS患者的GC凋亡率降低，且與凋亡效應(yīng)子Caspase-3水平的降低和抗凋亡蛋白水平的增加及較高的增殖率相關(guān)[18]。這提示GC的異常增殖和凋亡可能是卵泡發(fā)育異常的基礎(chǔ)。因此，探索PCOS女性GC異常增殖的機(jī)制具有重要意義。

MAPK/ERK通路由一系列細(xì)胞蛋白組成，這些蛋白促進(jìn)信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和分化[19-20]。其中ERK1/2的磷酸化可激活細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)解激素和生長因子的促有絲分裂作用，刺激卵巢GC的細(xì)胞增殖、分化和分泌的活性[21-22]，并抑制細(xì)胞凋亡[23]。據(jù)報(bào)道，在PCOS患者中，降低p-ERK1/2蛋白表達(dá)量，抑制MAPK/ERK通路異?；罨?，可改善PCOS胰島素抵抗[24]，并且可抑制從PCOS患者分離的卵巢GC增殖[25]。動(dòng)物研究也顯示，抑制ERK1/2磷酸化可增加小鼠卵巢GC凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，從PCOS模型大鼠卵巢中分離的GC中p-ERK1/2水平及GC活性均高于正常大鼠卵巢GC，而GC凋亡率低于正常大鼠卵巢GC，且使用PD98059抑制ERK1/2信號(hào)通路可降低GC活性，誘導(dǎo)GC凋亡。表明MAPK/ERK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)GC增殖和凋亡的重要通路。

CLDN6在生殖細(xì)胞腫瘤和EC、卵巢癌中高度表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)具有抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[9-12]。CLDN6受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，CLDN6主要通過ASK1參與細(xì)胞凋亡，而ASK1是MAPK激酶家族的成員，已被證明與CLDN6的水平呈正相關(guān)[13]。提示CLDN6主要通過MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究中，通過皮下注射DHEA誘導(dǎo)建立了PCOS大鼠模型，RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，PCOS模型大鼠卵巢組織和GC中CLDN6 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于正常大鼠卵巢組織和GC，并且其高表達(dá)與PCOS中GC的增殖活性升高趨勢一致。鑒于此，推測CLDN6可能通過MAPK/ERK信號(hào)通路參與PCOS中GC的增殖和凋亡。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證此推測，利用小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)和pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)/上調(diào)GC中CLDN6表達(dá)。結(jié)果顯示，GC中CLDN6表達(dá)水平上調(diào)，可升高GC的增殖活性，降低凋亡率，同時(shí)p-ERK1/2水平增加；而下調(diào)CLDN6表達(dá)顯示相反的結(jié)果；這提示CLDN6高表達(dá)與GC的異常增殖和凋亡有關(guān)。而MAPK/ERK信號(hào)通路是否參與CLDN6對(duì)GC異常增殖和凋亡的調(diào)控作用尚不明確。因此，本研究在上調(diào)CLDN6表達(dá)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用ERK1/2抑制劑PD98059以抑制ERK1/2活化，結(jié)果顯示，PD98059可升高Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平，降低Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平，減弱CLDN6高表達(dá)對(duì)GC增殖的促進(jìn)作用和GC凋亡的抑制作用；提示下調(diào)CLDN6可能通過抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，抑制PCOS大鼠卵巢GC增殖并誘導(dǎo)GC凋亡。

綜上所述，CLDN6在PCOS大鼠卵巢組織和GC中呈高表達(dá)，并且可能通過MAPK/ERK信號(hào)通路參與PCOS大鼠卵巢GC的增殖和凋亡。本研究從體外細(xì)胞水平上初步探究了CLDN6對(duì)PCOS大鼠卵巢GC增殖和凋亡的影響及可能的分子機(jī)制，尚需大樣本和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。