薄 云,劉 嘉,周 敏

(1.云南省第一人民醫(yī)院 a.麻醉科;b.婦產(chǎn)科，昆明 650100；2.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 a.麻醉科;b.婦產(chǎn)科，昆明 650012；3.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，昆明 650012)

宮頸癌是一種發(fā)生于宮頸上皮的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率位居女性腫瘤第二位，僅次于乳腺癌[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計，世界每年新增宮頸癌病例約50萬，其中約有30萬病例來源于經(jīng)濟落后國家或地區(qū)[2]。我國是宮頸癌高發(fā)國家，每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬，約占世界宮頸癌年發(fā)病總數(shù)的1/4～1/3[3]。近年伴隨社會文化、飲食習慣及生活方式的改變，宮頸癌的發(fā)病率明顯上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。有資料顯示，年輕女性宮頸癌發(fā)生率以每年2%～3%的速度迅速增長[3]。目前宮頸癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療和放療，其中手術(shù)是治療宮頸癌最主要的方式。越來越多的證據(jù)表明，麻醉技術(shù)和其他圍術(shù)期因素是影響惡性腫瘤手術(shù)后長期轉(zhuǎn)歸的潛在因素[4]。近年來，隨著麻醉藥抗腫瘤的作用及機制正在被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)工作者不斷的揭示，發(fā)現(xiàn)阿片類藥物能影響一些腫瘤細胞(如胃癌細胞、肺癌細胞)的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等[5-7]。芬太尼作為一款化學(xué)合成阿片類鎮(zhèn)痛藥被廣泛用于宮頸癌手術(shù)中。研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼具有抑制胃癌細胞增殖轉(zhuǎn)移、肺癌細胞轉(zhuǎn)移的功能[7-8]，但是芬太尼對宮頸癌細胞的影響尚不得知。本研究以宮頸癌細胞系為研究對象，體外探究芬太尼對宮頸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的影響，為臨床宮頸癌手術(shù)治療時麻醉藥物的選擇提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C33A細胞購于中國科學(xué)院細胞庫(中國上海)；芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基；CCK-8試劑盒購于MedChemExpress；Caspase 3、PARP1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K及GAPDH抗體均購于Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及干預(yù) C33A細胞在37℃、5% CO2、含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況1～2天換一次液。將細胞分為對照組和芬太尼組，將對數(shù)生長期細胞按2×103/孔接種于96孔板，待細胞貼壁，芬太尼組細胞分別加終濃度為10nmol/L、100nmol/L、100nmol/L的芬太尼刺激，培養(yǎng)一定時間后對C33A細胞進行增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡檢測。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖 取不同培養(yǎng)時間(0h、24h、48h、72h)細胞，使用CCK-8試劑盒檢測各組C33A細胞增殖情況。具體步驟：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞接種到96孔板，待細胞生長80%時，每孔加10μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，用酶標儀測定450nm處的吸光度值。

1.2.3 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化并混勻，按2×105細胞/孔鋪于6孔板，培養(yǎng)12h,待細胞貼壁，加相應(yīng)濃度的LukS-PV，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用胰蛋白酶消化細胞，1000r/min離心5min，收集細胞，用PBS洗滌2次，4℃條件下用70%乙醇過夜固定，用PBS洗滌2次，加0.5mL的PI/RNase staining染液，避光室溫孵育30min，上機檢測。

1.2.4 Transwell法檢測細胞遷移能力 取Transwell 48孔培養(yǎng)板(孔徑8μm，購于康寧公司)，下室加1mL含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，上室加0.5mL含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的C33A細胞懸液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12h，取上室濾膜和下室培養(yǎng)基，對濾膜進行結(jié)晶紫，顯微鏡下觀察濾膜下側(cè)細胞數(shù)；使用Muse Cell Analyer全能細胞狀態(tài)分析儀(默克密理博公司)對下室培養(yǎng)基中細胞數(shù)進行計數(shù)。

1.2.5 細胞凋亡檢測 收集干預(yù)48h后C33A細胞，立即使用Annexin Ⅴ-PI凋亡染色試劑盒對各組細胞進行染色；使用流式細胞儀(BD公司，Aria II)對細胞凋亡情況進行分析，采用固定流速(6mL/min)，收集1min，Q1+Q2+Q3門的細胞即為發(fā)生凋亡的細胞。

1.2.6 Real-time PCR 收集干預(yù)48h后C33A細胞，Trizol法提取細胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，Real-time PCR法檢測細胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參。MMP-2引物：上游5'-AGCCCGGAAGATATCGTTGA-3'，下游5'-GTGAACGCCTGGTAGCAATA-3'；MMP-9引物：上游5'-CACCTATGGCATATAGGAGG-3'，下游5'-AGAGGTTCGGTCTAAGCAAC-3'；N-cadherin引物：上游5'-CCGGCGTTATCTGCGATG-3'，下游5'-CTCTAGCAGGGAGGAGACTATTG-3'；GAPDH引物：上游5'-CCGGCTCGCTTAGCACA-3'，下游5'-AACACGGCGTAATTCGCTTT-3'。

1.2.7 Western blot檢測 收集干預(yù)48h后C33A細胞，加1mL RIPA裂解液，使用組織勻漿機對細胞進行勻漿，勻漿后的細胞放于冰上裂解5min，4℃、12000g離心5min，取上清。往上清液中加loading buffer(上清液體積：loading buffer體積=4∶1)；SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37℃封閉2h，抗人Caspase 3抗體(1∶1000)、PARP-1抗體(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)抗體、MMP-2抗體(1∶1000)、N-cadherin抗體(1∶1000)、MMP-9抗體(1∶1000)、Akt抗體(1∶1000)、p-Akt抗體(1∶1000)、PI3K、p-PI3K(1∶1000)，4℃孵育12h(GAPDH、Caspase 3、PARP-1、MMP-2、MMP-9、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K抗體均購于Abcam公司)。使用HRP標記的二抗37℃孵育1h，加ECL發(fā)光液曝光檢測。

2 結(jié) 果

2.1 芬太尼干預(yù)對宮頸癌細胞增殖的影響 相比于空白組，芬太尼刺激顯著減緩了C33A細胞增殖速度，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1)。

圖1 芬太尼干預(yù)對C33A細胞增殖的影響**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

2.2 芬太尼干預(yù)對宮頸癌細胞細胞周期的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相比于空白組，不同濃度芬太尼刺激后，C33A細胞周期被阻滯在G1/G0期，且芬太尼濃度越高，阻滯在G1/G0期的細胞越多(P<0.05)(圖2)。Western blot法結(jié)果顯示，與空白組相比，芬太尼刺激降低C33A細胞內(nèi)Cyclin D1蛋白及CDK4蛋白表達量，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖3)。

2.3 芬太尼干預(yù)對宮頸癌細胞細胞遷移的影響 Transwell試驗結(jié)果顯示，相比于空白組，芬太尼組穿膜細胞數(shù)顯著減少，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖4)。

圖2 不同濃度芬太尼干預(yù)后C33A細胞周期分布占比**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖3 芬太尼對C33A細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1和CDK4表達的影響**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖4 不同濃度芬太尼干預(yù)對C33A細胞遷移的影響**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

2.4 芬太尼干預(yù)對宮頸癌細胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin表達的影響 Real-time PCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示，芬太尼干預(yù)顯著降低C33A細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、N-cadherin的mRNA及蛋白表達水平(P<0.05)(圖5、6)，且呈劑量依賴性。

圖5 不同濃度芬太尼干預(yù)對C33A細胞MMP-2、MMP-9及N-cadherin mRNA表達的影響**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖6 不同濃度芬太尼干預(yù)對C33A細胞MMP-2、MMP-9及N-cadherin蛋白表達的影響**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05，△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

2.5 芬太尼干預(yù)對宮頸癌細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)及Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于空白組，芬太尼顯著增加了C33A細胞凋亡率及活化PARP1、Caspase 3含量，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖7)。

2.6 芬太尼干預(yù)對宮頸癌細胞凋亡的影響 Western blot結(jié)果顯示，相比于空白組，芬太尼干預(yù)顯著降低C33A細胞內(nèi)PI3K和Akt磷酸化水平(P<0.05)(圖8)，且呈劑量依賴性。

圖7 不同濃度芬太尼干預(yù)對C33A細胞凋亡的影響A:Annexin V-PI染色定量結(jié)果；B:Western blot檢測;cl-PARP1：PARP1剪切片段；cl-Caspase 3：Caspase 3剪切片段;**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖8 不同濃度芬太尼干預(yù)對C33A細胞內(nèi)PI3K/Akt通路影響**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05，△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

3 討 論

近年來麻醉藥抗腫瘤作用的研究逐漸增多，多數(shù)麻醉藥均能影響患者免疫系統(tǒng)功能和腫瘤細胞的活性，從而影響腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，阿片類藥物具有抑制腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的功能[9-10]。芬太尼是一種廣泛用于手術(shù)和癌癥治療的麻醉劑，在許多癌癥中能抑制細胞的生存能力和入侵，如芬太尼抑制結(jié)腸直腸癌的轉(zhuǎn)移[11]，芬太尼通過調(diào)節(jié)NF-κB抑制胃癌細胞生長[12-13]，芬太尼干預(yù)能降低胰腺癌細胞和細胞移植小鼠的細胞生存能力和腫瘤生長[14]。本研究利用宮頸癌細胞系C33A，探究芬太尼對宮頸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼顯著抑制C33A細胞增殖生長，且呈劑量依賴性；芬太尼能將C33A細胞周期阻滯在G1/G0期，繼而抑制C33A的增殖。Cyclin D1，即G1/S-特異性周期蛋白-D1，這種亞型的周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)形成復(fù)合物并作為它們的調(diào)節(jié)亞基，這兩種周期蛋白依賴性激酶對于G1到S期的轉(zhuǎn)變不可或缺，這種蛋白質(zhì)已被證明與腫瘤抑制蛋白Rb相互作用，并且這個基因被Rb積極調(diào)控表達。研究發(fā)現(xiàn)，該基因出現(xiàn)突變、擴增或過度表達會改變細胞周期進程，這些現(xiàn)象常發(fā)生在多種腫瘤中并可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，芬太尼干預(yù)能劑量依賴性地抑制Cyclin D1、CDK4表達，表明芬太尼是通過抑制Cyclin D1、CDK4，繼而阻滯細胞周期，抑制細胞增殖生長。同時還發(fā)現(xiàn)，芬太尼干預(yù)能劑量依賴性地促進C33A細胞凋亡，分子層面促進凋亡蛋白PARP1和Caspase 3的活化，表明芬太尼干預(yù)能促進C33A細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼具有劑量依賴性抑制C33A細胞轉(zhuǎn)移的作用。腫瘤細胞遷移與ECM密切相關(guān)，ECM是一類由細胞合成，然后分泌到細胞外的大分子物質(zhì)，主要由細胞之間的基質(zhì)和基底膜構(gòu)成，它能阻止腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移[16]。MMPs的活動是在轉(zhuǎn)錄水平上精密調(diào)控的，主要以酶原的形式分泌到細胞外。當腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時，首先激活前體酶原，特定細胞外基質(zhì)成分以及內(nèi)源性抑制劑相互作用，其活動控制喪失以后，MMPs和其組織抑制劑之間可能失去平衡[17]。此外，腫瘤在遷移與侵襲的過程中，常常伴隨上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，它是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程，其中N-cadherin是間充質(zhì)細胞表型標志蛋白[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼劑量依賴性降低細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9及N-cadherin表達水平，表明過芬太尼能通過抑制C33A細胞轉(zhuǎn)化抑制細胞轉(zhuǎn)移。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常改變是腫瘤細胞的重要生物學(xué)特性，其中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在維持細胞惡性生物學(xué)特性中起重要作用。細胞在一系列內(nèi)外因素的作用下，通過啟動PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼能劑量依賴性地抑制PI3K及Akt磷酸化，表明芬太尼抑制C33A細胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進C33A細胞凋亡與抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。但有關(guān)后續(xù)動物實驗及芬太尼用于宮頸癌的相關(guān)臨床實驗仍處于籌備階段，有待后續(xù)完善并報道。

綜上所述，芬太尼具有抑制宮頸癌細胞增殖生長、分化轉(zhuǎn)移以及促進其凋亡的作用，其作用分子機制與抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。