陳振烈,曹羽明,張 銘,張元珍,2

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430000；2.湖北省產(chǎn)前診斷與優(yōu)生臨床醫(yī)學(xué)研究中心,武漢 430000)

胎盤植入是指胎盤絨毛不同程度侵入子宮肌層,是臨床上導(dǎo)致嚴重產(chǎn)后出血、休克、圍產(chǎn)期緊急子宮切除甚至孕產(chǎn)婦死亡的重要原因,孕產(chǎn)婦病死率為1%～7%[1-5]。胎盤植入最常見的高危因素為前次剖宮產(chǎn)史及前置胎盤,此外,高齡妊娠、胎盤植入史、既往子宮穿孔史、多次流產(chǎn)史等也是重要高危因素[6-7]。近年來,有關(guān)胎盤植入的病理生理機制備受關(guān)注,隨著研究的不斷深入,滋養(yǎng)細胞侵襲力增加被認為是胎盤植入發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一[2]。目前滋養(yǎng)細胞異常侵襲的具體發(fā)生機制并不明確[8]。因此,研究胎盤植入滋養(yǎng)細胞的侵襲行為，探討調(diào)控滋養(yǎng)細胞侵襲性機制，可為臨床上預(yù)防、診斷和治療胎盤植入提供重要的思路。

Wnt信號基因家族可通過多種信號通路調(diào)節(jié)機體正常發(fā)育所必需的多種過程,包括細胞增殖、分化、極性、遷移和侵襲[9-10]。研究表明,Wnt信號基因家族成員的異常表達與多種腫瘤的生物學(xué)過程密切相關(guān),其中包括細胞增殖、遷移和侵襲等[11-13]。其中的重要成員之一Wnt2是目前多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究熱點[14-15]。鑒于滋養(yǎng)細胞具有與腫瘤細胞高度相似的生物學(xué)行為,Wnt信號基因家族及其信號通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為也備受關(guān)注[16-18]。目前,有關(guān)Wnt2在胎盤植入的作用尚未見相關(guān)報道。本文通過檢測Wnt2在植入胎盤組織中的表達及其對HTR-8/Svneo細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲中的作用,探究Wnt2在植入胎盤組織中的表達及對滋養(yǎng)細胞生物學(xué)功能的影響,旨在進一步闡明胎盤植入發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)機制,為臨床診治提供更多的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2020年7月至2021年1月于武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)的胎盤植入孕產(chǎn)婦胎盤組織15例(植入組)和正常胎盤組織15例(對照組)。胎盤植入患者均符合《胎盤植入診治指南(2015)》診斷標準：分娩前經(jīng)臨床高危因素結(jié)合彩色多普勒超聲或MRI征象評估,且最終確診根據(jù)手術(shù)中或分娩時所見或分娩后的病理學(xué)診斷[1]。兩組基本資料見表1。納入研究的孕產(chǎn)婦均排除妊娠期高血壓疾病、絨毛膜羊膜炎、糖尿病和胎盤早剝等病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過,孕產(chǎn)婦知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 胎盤娩出后,迅速取胎盤母體面胎盤組織2塊(約1.0cm×1.0cm×1.0cm),正常組選取母體面胎盤中間帶部位組織,植入組選取粘連或植入部位組織，取材時注意避開胎盤組織出血、壞死和鈣化處。一塊組織經(jīng)RNA穩(wěn)定保存液處理，-80℃保存，用于RT-PCR和Western blot檢測；另一塊標本常規(guī)處理后固定于10%福爾馬林溶液,以制備石蠟切片并進行免疫組化檢測。

1.2.2 細胞復(fù)蘇和培養(yǎng) HTR-8/Svneo細胞購自ATCC。從液氮中取出細胞凍存管，迅速置于37℃溫水,融化后轉(zhuǎn)移至15mL離心管,1000r/min離心5min,棄上清,用完全培養(yǎng)基重懸，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,采用10%胎牛血清(四季青)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)進行培養(yǎng),并加1%青霉素和鏈霉素(Gibco)預(yù)防細菌污染。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 將2×105細胞/mL的HTR-8/Svneo細胞懸液于6孔板鋪板,待細胞密度達60%～80%時用GP-transfect-Meta轉(zhuǎn)染試劑(吉瑪基因)轉(zhuǎn)染,用siRNA轉(zhuǎn)染HTR-8/Svneo細胞,37℃靜置培養(yǎng)細胞,6h換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA序列：陰性對照組(si-NC)sense 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3,antisense 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3；干擾組(si-Wnt2)sense 5-CCAGGGUGAUGUGCGAUAATT-3,antisense 5-UUAUCGCACAUCACCCUGGTT-3。

1.2.4 RNA提取和RT-PCR檢測 嚴格按RNA提取試劑盒(艾德萊生物)使用說明書提取胎盤組織和HTR-8/Svneo細胞總RNA,并嚴格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)使用說明書將1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(Vazyme)測定胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9表達水平和Wnt2基因敲低前后細胞中Wnt2、β-catenin、Bcl-2、Caspase-3、MMP-2和MMP-9表達水平。引物序列：Wnt2 F：5-TGACTGGACAACCGCTAC-3,R：5-GTGGGAAGACATTGAGAAAG-3；β-catenin F：5-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3,R：5-CGAGTCATTGCATACTGTCCAT-3；Bcl-2 F：5-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3,R：5-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3；Caspase-3 F：5-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3,R：5-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3；MMP-2 F：5-GCCCCCAAAACGGACAAAGA-3,R：5-TCCCAAGGTCCATAGCTCATCG-3；MMP-9 F：5-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3,R：5-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3。用CFX-connect(賽默飛)進行RT-PCR檢測,記錄各待測目的基因相對于閾值循環(huán)(Ct)值數(shù)值,通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。

1.2.5 蛋白提取和Western blot檢測 嚴格按細胞蛋白提取試劑盒(碧云天)使用說明書提取胎盤組織和HTR-8/Svneo細胞總蛋白,嚴格按BCA試劑盒(碧云天)使用說明書操作步驟檢測各組總蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE膠進行電泳分離,采用半干濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜到PVDF膜(Millipore),經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1h,采用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜。一抗有Wnt2兔單抗(1∶2000,Abcam),β-catenin兔單抗(1∶2000,Abcam),Bcl-2兔單抗(1∶2000,Abcam),Caspase-3兔單抗(1∶2000,Abcam),MMP-2兔單抗(1∶2000,Abcam),MMP-9兔單抗(1∶2000,Abcam)。用TBST洗膜3次,每次5min,將膜用相對應(yīng)的二抗(1∶5000,Abcam)在室溫下孵育1～1.5h,用TBST洗膜3次,用ECL發(fā)光法進行顯影。

1.2.6 細胞凋亡檢測 取生長狀況良好的對數(shù)生長期HTR-8/Svneo細胞,按2×105細胞/孔接種于6孔板,檢測敲低Wnt2表達對HTR-8/Svneo細胞凋亡的影響。細胞培養(yǎng)48h，嚴格按細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書操作步驟處理,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 細胞遷移檢測 Transwell遷移實驗：取5×104經(jīng)轉(zhuǎn)染的HTR-8/Svneo細胞懸浮于500μL不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基中,加Transwell小室上室(孔徑8μm；Corning)。下室中加600μL含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h,待細胞侵入Transwell小室下層,用多聚甲醛固定后進行結(jié)晶紫染色,并通過Olympus IX71熒光倒置顯微鏡明場成像,每個小室取5個視野進行細胞計數(shù),取其平均值,本實驗重復(fù)3次。

1.2.8 細胞侵襲檢測 Transwell侵襲實驗：取轉(zhuǎn)染后HTR-8/Svneo細胞5×104懸浮于500μL不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基,加已鋪備好Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室(下室加600μL含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h,待細胞侵入Transwell小室下層,多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色,通過Olympus IX71熒光倒置顯微鏡明場成像,每個小室取5個視野進行細胞計數(shù),取其平均值,本實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕婦的基礎(chǔ)資料比較 對照組和胎盤植入組孕產(chǎn)婦的年齡、孕周、妊娠次數(shù)、產(chǎn)次和剖宮產(chǎn)次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組孕婦一般情況比較

2.2 兩組產(chǎn)婦胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9表達情況 與對照組胎盤組織相比,植入組胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達量顯著增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),見圖1。

圖1 兩組產(chǎn)婦胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9表達情況A:對照組和植入組胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9 mRNA相對表達量比較;B:對照組和植入組胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量比較

2.3 敲低Wnt2對HTR-8/Svneo細胞凋亡的影響 si-Wnt2組細胞Wnt2 mRNA和蛋白相對表達量顯著低于si-NC組細胞(均P<0.05),見圖2A。si-Wnt2組細胞48h時凋亡率顯著高于si-NC組細胞(P<0.01),見圖2B。

2.4 敲低Wnt2對HTR-8/Svneo細胞遷移和侵襲的影響 Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,si-Wnt2組24h遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著低于si-NC組(均P<0.01),見圖2C、D。

圖2 敲低Wnt2對HTR-8/Svneo細胞遷移和侵襲的影響A:兩組細胞中Wnt2 mRNA和Wnt2蛋白相對表達量；B:兩組細胞分別培養(yǎng)48后細胞凋亡比較；C:兩組細胞分別培養(yǎng)24h后細胞遷移比較；D:兩組細胞分別培養(yǎng)48h后細胞侵襲比較

2.5 敲低Wnt2對HTR-8/Svneo細胞相關(guān)蛋白的影響 與si-NC組相比,si-Wnt2組細胞的β-catenin、Bcl-2、MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白相對表達量顯著減少(均P<0.05),Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達量顯著升高(P<0.01),見圖3。

圖3 敲低Wnt2對HTR-8/Svneo細胞相關(guān)蛋白的影響A～E:分別為兩組細胞中β-catenin、Bcl-2、Caspase-3、MMP-2和MMP-9 mRNA相對表達量比較；F:兩組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量比較

3 討 論

胎盤植入是臨床上造成產(chǎn)后出血、圍產(chǎn)期緊急子宮切除和孕產(chǎn)婦死亡的重要原因。近年來,胎盤植入的發(fā)生率迅速上升,較前升高近20倍,其發(fā)生率已高達1/533[19]。既往研究表明,在胎盤植入的發(fā)生過程中,絨毛膜外滋養(yǎng)細胞(extrachorionic trophoblast,EVT)的侵襲力和數(shù)量均顯著增加,但其具體發(fā)生機制尚未明確[17]。多項體內(nèi)研究表明,Wnt信號基因家族在胚外組織發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用,特別是在胎盤血管形成、絨毛膜-尿囊融合和迷宮功能中,而Wnt2就是其中關(guān)鍵成員之一[20]。Monkley等[21]研究發(fā)現(xiàn)，約50%的Wnt2表達缺失的胎鼠在圍產(chǎn)期死亡,進一步組織學(xué)分析顯示,Wnt2表達缺失小鼠胎盤組織中毛細血管數(shù)量明顯減少,且纖維蛋白樣物質(zhì)數(shù)量增加,表明Wnt2是小鼠胎盤血管正常形成所必需的。Boyer等[22]也發(fā)現(xiàn)，Wnt2缺陷型小鼠的胎盤組織中顯示出不同的缺陷,如組織水腫、毛細血管數(shù)目減少和纖維蛋白樣沉積。Li等[23]報道,復(fù)發(fā)性自發(fā)流產(chǎn)孕產(chǎn)婦胎盤絨毛組織中Wnt2蛋白表達量顯著低于正常孕產(chǎn)婦胎盤絨毛組織,且體外實驗顯示,過表達Wnt2可促進滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移能力。本研究結(jié)果顯示，植入胎盤孕產(chǎn)婦胎盤組織中Wnt2、MMP-2和MMP-9表達量較對照組均顯著增加,提示其與胎盤植入的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

EVT的遷移和侵襲能力受到其自身分泌的多種細胞因子、蛋白酶和炎癥介質(zhì)調(diào)控,其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族被認為是其重要調(diào)控成分。MMPs家族作為一類鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶,可通過降解細胞膠原產(chǎn)物,破壞細胞內(nèi)基質(zhì)成分,在滋養(yǎng)細胞侵襲、子宮螺旋動脈重鑄和血管再生中發(fā)揮重要作用。Kocarslan等[24]研究發(fā)現(xiàn),MMP-2在胎盤植入胎盤組織中的表達較正常胎盤組織顯著增強,表明MMP-2可能在胎盤形成過程中發(fā)揮重要作用。Sonderegger等[25]提出,經(jīng)典Wnt信號可刺激MMP-2的Wnt依賴性分泌,這可能是促進滋養(yǎng)層細胞侵襲能力的關(guān)鍵Wnt靶標之一。Zeng等[26]體外研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)MMP-9表達可促進HTR-8/Svneo胞的遷移和侵襲能力。在正常胎盤種植過程中,一部分EVT侵襲蛻膜,形成間質(zhì)性滋養(yǎng)細胞,其可進一步侵襲至子宮肌層內(nèi)側(cè)1/3,彌漫形成多核滋養(yǎng)層巨細胞[27]。研究顯示，胎盤植入患者胎盤中間質(zhì)性滋養(yǎng)細胞侵襲子宮肌層深度較正常胎盤組織顯著增加,且胎盤中多核滋養(yǎng)層巨細胞數(shù)顯著增加[28]。細胞凋亡是一個極其重要的生物過程,在很多病理過程中起著至關(guān)重要的作用,而B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究通過使用siRNA敲低HTR-8/Svneo細胞Wnt2表達,發(fā)現(xiàn)細胞凋亡增加、遷移和侵襲能力下降,細胞中β-catenin、Bcl-2、MMP-2和MMP-9表達顯著下降,Caspase-3表達顯著上升。表明Wnt2可能通過wnt/β-catenin信號通路調(diào)控Bcl-2、Caspase-3、MMP-2和MMP-9表達,進而影響胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。

綜上所述,Wnt2與胎盤植入的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切,可能通過wnt/β-catenin信號通路調(diào)控參與了胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為,為進一步研究植入性胎盤發(fā)生發(fā)展機制提供了依據(jù)和新的方向。