方海仙，耿慧春，普婭麗，王莉麗，李昕昀，劉宏程

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（昆明），云南 昆明 650205；3.元江縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，云南 元江 653300；4.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，云南 昆明 650106）

洋蔥[1-3]是百合科蔥屬2年生草本植物的鱗莖，是人們生活中必不可少的蔬菜，具有降血壓、預(yù)防血栓形成、防癌抗癌、降低血糖、殺菌消炎、補(bǔ)充人體微量元素、預(yù)防感冒、治療口腔潰瘍等多種功效。同時(shí)，洋蔥也是一類較為特殊的蔬菜，其中含有大量的烷基硫代半胱氨酸、亞砜類化合物等及其活性酶，在粉碎樣品制成漿狀后會產(chǎn)生大量含硫化合物[4-5]，在農(nóng)藥殘留檢測中會產(chǎn)生干擾，在日常檢測中屬于較難分析的樣品。

洋蔥在生長過程中，由于田間雜草影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，會使用除草劑除草。除草劑能使雜草徹底或者選擇發(fā)生枯死，被廣泛地應(yīng)用于各種草害的防治，但是，它在農(nóng)業(yè)生長中長期大量使用，不可避免地造成了越來越多的殘留。目前已研究報(bào)道較多的除草劑主要有酰胺類、三嗪類、磺酰脲類、二硝基苯胺類、苯脲類、二苯醚類、苯氧羧酸類和咪唑啉酮類[6]，其中，酰胺類除草劑是一類高效、高選擇性的芽前除草劑，分為氯代酰胺類和酰芳胺類，主要用于防除1年生禾本科雜草與部分闊葉雜草，被應(yīng)用于防治洋蔥生長過程中的草害。氯代酰胺類除草劑能提高作物產(chǎn)量，同時(shí)也對環(huán)境和人體造成了嚴(yán)重危害，研究表明[7]，它們的代謝物能夠引起人類淋巴細(xì)胞的姐妹染色單體的交換，乙草胺和丁草胺具有弱的基因毒性，乙草胺已被美國環(huán)保局定位B-2 類致癌物，因此，該類除草劑殘留檢測在限量范圍內(nèi)才能保證食用安全性。

蔥蒜類蔬菜富含蒜氨酸類物質(zhì)（即烷基硫代半胱氨酸和它的亞砜類化合物），該物質(zhì)是最初且最重要的含硫化合物，是天然存在的內(nèi)源性非蛋白氨基酸，不同的植物中蒜氨酸類物質(zhì)的成分和含量不同，洋蔥中主要是蒜氨酸、甲基蒜氨酸和丙基蒜氨酸。蒜氨酸酶又稱蒜酶，它是一種糖蛋白，有二聚體、三聚體、四聚體等形式，不同的植物蛋白聚合形式是不同的，洋蔥為四聚體[8]。在完整的細(xì)胞內(nèi)，蒜氨酸酶和底物位于細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)部位，蒜氨酸類物質(zhì)以穩(wěn)定、無臭的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，能分解蒜氨酸類物質(zhì)的蒜酶位于液泡中，液泡周圍充滿了細(xì)胞質(zhì)，由于膜作為屏障，所以，二者無法接觸。當(dāng)細(xì)胞遭到破壞，如擠壓、粉碎等作用時(shí)，蒜氨酸酶與底物相互接觸發(fā)生反應(yīng)生成丙酮酸、氨和包括蒜素在內(nèi)的含硫化合物。在日常的殘留檢測中，蒜氨酸類物質(zhì)本身不會干擾檢測，但樣品被粉碎時(shí)，其內(nèi)含的活性酶與底物接觸后產(chǎn)生大量的含硫化合物，該類物質(zhì)與農(nóng)藥性質(zhì)相近，易與農(nóng)藥一起提取出來，且含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于農(nóng)藥殘留的含量，在色譜和質(zhì)譜測定中造成很強(qiáng)的背景干擾。目前，日常采用的一些國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)前處理方法，無法將這類物質(zhì)去除。因此，建立一種能夠有效消除硫化物干擾、準(zhǔn)確性好的氯代酰胺類除草劑殘留檢測方法對洋蔥質(zhì)量控制具有重要的研究意義。

微波[9-10]是指波長在1～1 000 mm的電磁波，具有穿透、反射和吸收特性，用微波加熱時(shí)食物會吸收微波而使自身發(fā)熱。微波處理通過加熱鈍化酶的活性而作為一種鈍酶技術(shù)[11-12]，其作用機(jī)理主要是基于微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)是指微波作用于物料，使物料表里同時(shí)吸收微波能，溫度升高后使酶分子發(fā)生不可逆變性，導(dǎo)致失活，達(dá)到鈍化酶的目的。非熱效應(yīng)[13-15]是指在微波電磁場的作用下物料中酶的空間結(jié)構(gòu)被干擾和破壞，致使酶的分子結(jié)構(gòu)中氫鍵松弛、斷裂，使酶的親和力降低，最終導(dǎo)致酶活力下降。如傅偉昌等[16]采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)研究微波處理對松花粉脂肪酶滅活率，結(jié)果表明，當(dāng)松花粉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%、微波功率324.3 W、微波時(shí)間2 min 時(shí)，脂肪酶滅活率為92.4%。因此，微波處理通過控制溫度可用于鈍化酶的活性，將含硫蔬菜硫化物截留在樣品前處理階段。

本研究根據(jù)含硫化合物產(chǎn)生的特點(diǎn)，采用微波處理鈍化蒜酶的活性，避免含硫化合物的產(chǎn)生，在殘留檢測時(shí)能有效解決背景干擾問題，通過優(yōu)化量化微波處理?xiàng)l件，得到最優(yōu)的前處理?xiàng)l件，建立酰胺類除草劑殘留分析檢測方法，為洋蔥的安全性監(jiān)控和評價(jià)提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

GC-7890B 氣相色譜（配有7683 自動(dòng)進(jìn)樣器、63Ni電子捕獲檢測器μECD，美國安捷倫公司）；TDL-40B 低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HY-5A 振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國海道爾夫公司）；電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；水浴氮吹儀（美國Organomation N-EVAP 公司）；渦旋振蕩器（美國Thermo Scientific 公司）；LG 微波爐（樂金電子（天津）電器有限公司，工作頻率為2.45 GHz 的瓷控管微波爐）。

甲草胺GBW（E）081400、乙草胺GBW（E）061615、丙草胺GBW（E）081564、異丙甲草胺GBW（E）081402、丁草胺GBW（E）061412，以上標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL，購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（天津）。

弗羅里矽（Florisil）固相萃取柱（1 g，6 mL，美國Supelco 公司）。正己烷（色譜純，美國J.T.Baker 公司）；丙酮（色譜純，美國J.T.Baker公司）；乙腈（分析純）；氯化鈉（分析純）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制 分別移取乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺、丙草胺1.0 mL用正己烷定容至25.0 mL，配制成單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯存在-20 ℃冰箱中。準(zhǔn)確吸取一定體積各單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷定容至25.0 mL，得到5 種氯代酰胺類的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存在-4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 樣品微波處理

1.2.2.1 洋蔥大小確定 洋蔥一層層剝開，分別切成大小約為4、2、1 cm2的片，準(zhǔn)確稱取35.0 g試樣至250 mL 三角瓶中，加入70.0 mL 乙腈，在勻漿機(jī)中以16 000 r/min勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7～10 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液50～60 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.2.2 微波功率密度確定 洋蔥一層層剝開，切成大小約1 cm2的片，準(zhǔn)確稱取35.0 g試樣至250 mL三角瓶中，三角瓶口用鋁箔紙封好待用。將上述裝好樣品的三角瓶置于微波工作站的加熱腔內(nèi)轉(zhuǎn)盤中央，固定微波時(shí)間為20 s，分別在微波功率密度為0、2、6、10、14、20 W/g處理后，取出后待冷卻至室溫，再加入70.0 mL 乙腈，在勻漿機(jī)中16 000 r/min勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7～10 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液50～60 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.2.3 微波時(shí)間密度確定 洋蔥一層層剝開，切成大小約1 cm2的片，準(zhǔn)確稱取35.0 g 試樣至250 mL 三角瓶中，三角瓶口用鋁箔紙封好待用。將上述裝好樣品的三角瓶置于微波工作站的加熱腔內(nèi)轉(zhuǎn)盤中央，固定微波功率為14 W/g，微波時(shí)間密度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 s/g 處理后，取出后待冷卻至室溫，再加入70.0 mL乙腈，在勻漿機(jī)中16 000 r/min勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7～10 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液50～60 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.3 樣品的凈化 從具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈溶液，放入150 mL濃縮瓶中，將濃縮瓶用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，加入2.0 mL正己烷，蓋上鋁箔，待凈化。

將弗羅里矽柱依次用5.0 mL 丙酮＋正己烷（10∶90（V/V））、5.0 mL 正己烷預(yù)淋洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用150 mL 濃縮瓶接收洗脫液，用5 mL 丙酮＋正己烷（10∶90（V/V））沖洗燒杯后淋洗弗羅里矽柱，并重復(fù)一次。將盛有淋洗液的濃縮瓶在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（水浴溫度＜40 ℃）濃縮至近干，用正己烷定容至5.0 mL，在漩渦混合器上混勻，分別移入2 個(gè)2 mL自動(dòng)進(jìn)樣器樣品中，供色譜測定。

1.2.4 氣相色譜條件優(yōu)化 色譜柱為DB-17 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氮?dú)猓?9.999%），恒流模式，柱流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為1.00 μL，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為200 ℃；尾吹氣流量為60.0 mL/min；微電子捕獲檢測器（μECD）溫度為320 ℃；柱溫升溫程序：初始溫度150 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至270 ℃，保持15 min。

1.2.5 工作曲線繪制 分別移取適量的5 種氯代酰胺類混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷稀釋得到一系列工作使用溶液。按照1.2.4 的條件進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法定量，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。

1.2.6 添加回收試驗(yàn) 分別稱取不含5 種氯代酰胺類除草劑殘留的洋蔥樣品10 份，每份35.0 g，其中1 份為對照，另外9 份樣品分為3 組，每組3 份。第1組每份均加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL，使樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 mg/kg；第2 組添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 mg/kg；第3 組添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL 使樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25 mg/kg，分別將上述樣品充分混勻，放置1 h 后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4 進(jìn)行樣品前處理和分析測定，每個(gè)添加濃度重復(fù)測定3 次，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 實(shí)際樣品測定 在開始對樣品進(jìn)行GCECD 測試之前，先測定標(biāo)準(zhǔn)工作液，直至相應(yīng)組分色譜響應(yīng)值穩(wěn)定后開始進(jìn)標(biāo)樣，制作校正曲線，之后進(jìn)行樣品測定。

隨機(jī)測試送檢的10批次樣品，分別按照1.2.2、1.2.3和1.2.4進(jìn)行前處理和分析測定。

1.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)指的是樣品中除分析物以外的組分，常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)按照以下公式[17]進(jìn)行計(jì)算。

當(dāng)ME為正值時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)ME為負(fù)值時(shí)，為基質(zhì)減弱效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)在-20%～20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，在-50%～-20%和20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，超過-50%或50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理時(shí)樣品狀態(tài)的選擇

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)樣品的狀態(tài)對微波處理效果有較大影響。試驗(yàn)表明，樣品不滅活處理，背景干擾相當(dāng)強(qiáng)，無法進(jìn)行殘留測定；粉碎后的樣品經(jīng)微波滅活后，消除基質(zhì)干擾的作用不明顯，對殘留測定仍有較大影響。因此，本試驗(yàn)將洋蔥一層層剝開后切成大小約為4、2、1 cm2的片，經(jīng)1.2.2.1 和1.2.3處理后，采用1.2.4氣相色譜條件上機(jī)測定，結(jié)果如圖1所示。

從圖1 可以看出，當(dāng)洋蔥大小為4 cm2時(shí)，雜質(zhì)干擾最少，但存在勻漿時(shí)較難將其勻漿細(xì)的問題，當(dāng)洋蔥大小為2、1 cm2時(shí)，干擾相對較大，但沒有明顯差別，體積小時(shí)勻漿時(shí)容易將其勻漿細(xì)。綜合考慮，洋蔥大小確定為1 cm2。

2.2 微波功率密度的確定

從圖2 可以看出，當(dāng)微波功率密度≤10 W/g時(shí)，與未微波處理比較，雜質(zhì)干擾更大，可能原因是這個(gè)微波功率密度下，酶的活力更強(qiáng)，加速了酶促反應(yīng)；當(dāng)微波功率密度≥14 W/g 時(shí)，微波處理對雜質(zhì)干擾具有明顯的效果，微波功率密度太大，樣品易于失水而烤糊，基于此，本試驗(yàn)選用微波功率密度為14 W/g。

2.3 微波時(shí)間密度的確定

由圖3 可知，當(dāng)微波時(shí)間密度≤0.5 s/g 時(shí)，跟未微波處理比較，雜質(zhì)去除效果不明顯，當(dāng)微波時(shí)間密度≥0.7 s/g 時(shí)，微波處理對雜質(zhì)干擾具有明顯的效果，微波時(shí)間密度大，樣品易于失水而不易提取，基于此，本試驗(yàn)選用微波時(shí)間密度為0.7 s/g。

2.4 微波處理后的色譜分析

在1.2.4條件下，洋蔥不同處理的色譜及5種氯代酰胺類除草劑色譜分析如圖4、5所示。

從圖4—5 可以看出，未經(jīng)微波處理洋蔥雜峰很多，峰很高，幾乎無法測定低濃度農(nóng)藥殘留；而微波處理后的洋蔥，雜峰明顯減少，峰很小，有效地消除了其基質(zhì)中硫化物對待測物的干擾，表明微波處理可有效減少硫化物的干擾。

2.5 色譜條件的優(yōu)化

為了得到5 種氯代酰胺類除草劑的最佳峰型和分離效果，本試驗(yàn)從不同程序升溫、進(jìn)樣口溫度、流量、檢測器溫度、不同色譜柱等方面對儀器的檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，比較了5 種農(nóng)藥在DB-1 和DB-17這2根不同極性色譜柱上的響應(yīng)，其色譜結(jié)果如圖6所示。

從圖6可以看出，相同濃度的氯代酰胺類除草劑在色譜柱DB-17 上的響應(yīng)比較大，靈敏度高，而在色譜柱DB-1 上的響應(yīng)較差，因此，本試驗(yàn)選用DB-17色譜柱。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限 配制質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的5種氯代酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）。

從表1可以看出，在線性范圍內(nèi)，5種氯代酰胺類除草劑的線性范圍為0.01～1.00 μg/mL，相關(guān)系數(shù)≥0.999，線性關(guān)系良好，異丙甲草胺表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，乙草胺、丁草胺和丙草胺為中等基質(zhì)效應(yīng)，甲草胺為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。因此，準(zhǔn)確定量時(shí)，需要配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計(jì)算。

表1 5種氯代酰胺類除草劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)Tab.1 Linear equations，correlation coefficients（r）and matrix effect of the five amide herbicides

2.6.2 準(zhǔn)確度和精密度 對空白洋蔥樣品添加不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.6 進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做3 個(gè)平行樣品，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以信噪比（S/N）≥3 確定檢出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10 確定定量限（LOQ）。

從表2 可以看出，5 種氯代酰胺類除草劑的平均回收率為85.7%～109.0%，RSD 為0.206%～4.710%，說明該方法回收率高，穩(wěn)定性好，能達(dá)到殘留分析的要求。

表2 5種酰胺類除草劑的回收率、精密度、檢出限、定量限Tab.2 Limits of detection（LODs，S/N=3），limits of quantification（LOQs，S/N=10），recoveries and precisions of the five amide herbicides

3 結(jié)論與討論

在日常的殘留檢測中，洋蔥所含蒜氨酸類物質(zhì)本身不會干擾檢測，但樣品被粉碎時(shí)，其內(nèi)含的活性酶與底物接觸后產(chǎn)生大量的含硫化合物，該類物質(zhì)與農(nóng)藥性質(zhì)相近，易與農(nóng)藥一起提取出來，且含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于農(nóng)藥殘留的含量，在色譜和質(zhì)譜測定中造成很強(qiáng)的背景干擾，通過一般的凈化方法很難將其除去。基于此，本試驗(yàn)根據(jù)洋蔥含硫化合物產(chǎn)生的特點(diǎn)，在樣品未被完全破壞時(shí)，采用微波處理鈍化蒜酶的活性，切斷蒜酶催化蒜氨酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，避免含硫化合物的產(chǎn)生，從而將含硫化合物等基質(zhì)干擾截留在樣品前處理階段，有效解決殘留測定時(shí)背景干擾問題。通過微波功率密度和微波時(shí)間密度2 個(gè)因素衡量微波處理對洋蔥雜質(zhì)去除效果，降低背景干擾對檢測的影響，建立了微波處理-氣相色譜法測定洋蔥中5 種氯代酰胺類除草劑殘留的分析方法。在優(yōu)化的色譜條件下，5 種氯代酰胺類除草劑色譜分離度好，峰型好，加標(biāo)回收率結(jié)果滿意，精密度、重現(xiàn)性滿足農(nóng)藥殘留要求，可滿足日常檢測。