閆冬梅，薛美昭，儀慧蘭，郝麗宏，喬嘉欣

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619）

葡萄（Vitis viniferaL.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其漿果發(fā)育和采后生理直接影響著果實(shí)的品質(zhì)、產(chǎn)量和貨架期，因此，研究葡萄果實(shí)品質(zhì)形成、采后衰老及品質(zhì)劣變的分子機(jī)制具有重要意義。高質(zhì)量的RNA 是后續(xù)進(jìn)行RT-PCR、qRT-PCR、Northern blot、CDS擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)研究的必要前提。但因葡萄果實(shí)富含多糖多酚等次生代謝物質(zhì)，難以獲取高質(zhì)量的RNA，制約了上述分子機(jī)制的研究進(jìn)程。其中，酚類化合物在勻漿時(shí)極易被氧化成醌類物質(zhì)，與RNA不可逆地結(jié)合，從而影響RNA 的分離純化[1-2]。多糖的理化性質(zhì)與RNA 相似，在提取過(guò)程中能與RNA共沉淀，很難將它們分開(kāi)[3]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄果實(shí)中總酚等次生代謝物的含量也隨之增加[4]，使得RNA的提取更加困難。

目前，已經(jīng)發(fā)展了多種RNA 的提取方法，如異硫氰酸胍法、熱硼酸法、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法 等[5-7]。其中，異硫氰酸胍能強(qiáng)烈抑制組織及提取液中RNase 的活性，但異硫氰酸胍法僅適用于次生代謝物含量少的組織材料[8-9]；SDS在常溫下就有較強(qiáng)的裂解效果，結(jié)合酚、氯仿抽提，SDS法可以有效去除植物組織中的多糖[3]；熱硼酸法中，硼酸能與酚類物質(zhì)形成復(fù)合物，從而避免多酚的干擾，蛋白酶K 和醋酸鉀分別能除去蛋白質(zhì)和多糖，但是該法所需藥品多、價(jià)格高、操作較復(fù)雜[10]；CTAB 在高離子濃度溶液中能與蛋白質(zhì)、多酚和中性多聚糖共沉淀，同時(shí)使核酸溶解達(dá)到分離核酸的目的，CTAB 法提取效率高，產(chǎn)物純度高，且所需藥品簡(jiǎn)單，是提取富含多糖多酚植物組織總RNA較有效的一種方法[11]。

基于CTAB法提取RNA的原理，近期國(guó)內(nèi)外已報(bào)道有適用于葡萄多種組織的RNA提取方法[12-14]，但從葡萄成熟果實(shí)中獲取高質(zhì)量總RNA 的方法還鮮有報(bào)道。本研究建立了改良CTAB 法，提取成熟的玫瑰香葡萄果實(shí)總RNA，得到高質(zhì)量的RNA，并順利完成了RT-PCR、qRT-PCR 和CDS 擴(kuò)增等試驗(yàn)，該方法通過(guò)從完全成熟、富含花色素的葡萄鮮果和貯藏果實(shí)組織中提取總RNA，旨在為葡萄分子生物學(xué)的研究提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

從葡萄園中采摘商業(yè)成熟的玫瑰香葡萄（Muscat Hamburg）果穗，立即運(yùn)至試驗(yàn)冷庫(kù)（（-1.0±0.5）℃）。剔除有外傷的顆粒，按5 kg 一箱分裝，預(yù)冷12 h 后放入SO2保鮮劑，扎緊袋口。根據(jù)課題組前期研究，在采后經(jīng)SO2保鮮的60 d內(nèi)，玫瑰香葡萄果實(shí)的總酚含量呈上升趨勢(shì)，糖含量維持在較高水平[4，15]，故分別取貯藏0 d 和60 d 的葡萄果粒若干，經(jīng)液氮速凍處理后存于-80 ℃冰箱備用。

CTAB、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K40）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、β-巰基乙醇（分析純）（北京索萊寶科技有限公司）；二乙基焦碳酸酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）、亞精胺、酸性酚（分析純）（上海生工生物工程股份有限公司）；氯化鈉（NaCl）、乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇（分析純）（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；EasyScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒、EasyTaqDNA Polymerase 試劑盒、EasyPureQuick Gel Extraction Kit 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII PCR Kit 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒法提取總RNA 購(gòu)買TransGen 公司的TransZolUp 試劑盒（試劑盒A）和TransZolPlant試劑盒（試劑盒B），GeneAll公司的RibospinTMSeed/Fruit試劑盒（試劑盒C），按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中的方法提取葡萄果皮總RNA。

1.2.2 改良CTAB法提取總RNA 本研究建立的改良CTAB法，RNA提取緩沖液用0.1%DEPC水配制，各組分終質(zhì)量濃度為2%（w/V）CTAB，2%（w/V）PVP-K40，0.1 mol/L的Tris-HCl（pH值8.0），0.1 mol/L的EDTA（pH 值8.0），2.5 mol/L 的NaCl，0.5 g/L 的亞精胺。配制完成后，121 ℃滅菌60 min。使用前加入1.5%的β-巰基乙醇。

取0.1 g 葡萄果皮在液氮中研磨成粉末狀，迅速移入離心管內(nèi)，加入1 mL 經(jīng)65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液，劇烈振蕩混勻，65 ℃孵育10～20 min。加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），渦旋混勻，于8 500 r/min 離心15 min（抽提2 次）。取上清，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻后于4 ℃放置0.5～1.0 h，于8 500 r/min 離心30 min；去上清，75%乙醇（DEPC 水配制）清洗沉淀2 次，室溫下風(fēng)干，加入500 μL的DEPC水，得到核酸粗提物。

之后，加入等體積的酸性酚-氯仿（5∶1，V/V），渦旋混勻，于14 000 r/min 離心10 min（抽提2 次），取上清加入0.1倍體積的5 mol/L NaCl溶液和1.1倍體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），渦旋混勻，于14 000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積的異丙醇，混勻后于4 ℃放置0.5～1.0 h，于8 500 r/min離心30 min；去上清，75%乙醇清洗沉淀2次，室溫下風(fēng)干，加入20～30 μL DEPC水溶解，得到總RNA樣品。

RNA 提取過(guò)程中所用DEPC 水體積分?jǐn)?shù)均為0.1%，離心均在4 ℃下進(jìn)行。

1.2.3 RNA 質(zhì)量檢測(cè) 取2 μL 總RNA 樣品進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V恒壓電泳15 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，分析RNA的完整性。取2 μL 總RNA 樣品，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的A260/A280、A260/A230及其質(zhì)量濃度。

1.2.4 RT-PCR檢驗(yàn) 根據(jù)試劑盒EasyScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix 的操作說(shuō)明將改良CTAB 法提取的RNA 合成cDNA 第1 鏈。以得到的cDNA 為模板，按照EasyTaqDNA Polymerase 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行半定量PCR，反應(yīng)體系20 μL。擴(kuò)增基因包括內(nèi)參基因Actin2，病程相關(guān)蛋白基因CHI3、CHI1b、GLU、PR1和PR6，引物序列如表1 所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 內(nèi)參基因及抗病相關(guān)基因的引物Tab.1 Primers for internal reference gene and disease resistance related genes

1.2.5 qRT-PCR 檢驗(yàn) 根據(jù)試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 的操作說(shuō)明將改良CTAB 法提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第1 鏈，之后用SYBR Premix Ex TaqTMII PCR Kit 試劑盒進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。檢測(cè)內(nèi)參基因Actin7（上游引物：CTTGCATCCCTCAGCACCTT；下游引物：TCCTGTG GACAATGGATGGA）的表達(dá)情況，每組重復(fù)4次。

1.2.6 葡萄基因CDS 的擴(kuò)增 以1.2.4 中合成的cDNA 為模板，依據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中葡萄VvMYBPA1基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)合成引物（上游引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATG GGCAGAGCACCTTGT；下游引物：GGGGACCACTT TGTACAAGAAAGCTGGGTAAATGAGTAGTGATTC GGC），使用高保真克隆酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)誤后，用EasyPureQuick Gel Extraction Kit 回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的完整性

瓊脂糖凝膠電泳是檢驗(yàn)RNA 完整性的常規(guī)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試劑盒A和試劑盒B的提取物中沒(méi)有檢出RNA條帶（圖1-A、B）；試劑盒C提取的葡萄RNA 有著極淺的28S 和18S 條帶（圖1-C）；用改良CTAB法提取成熟葡萄果實(shí)中的RNA，得到貯藏初期和貯藏60 d 葡萄果實(shí)總RNA，具有典型的28S、18S和5S帶型，且條帶未見(jiàn)彌散現(xiàn)象，其中28S條帶亮度約為18S 的2 倍，沒(méi)有蛋白和DNA 污染（圖1-D）。結(jié)果表明，該改良CTAB 法可以高效提取成熟葡萄果皮的總RNA。

2.2 總RNA的純度與得率

因試劑盒A 和試劑盒B 沒(méi)有得到有效的RNA產(chǎn)物，故只對(duì)另2 種方法提取的RNA 進(jìn)行核酸定量。一般來(lái)講，高質(zhì)量RNA 的A260/A280在1.8～2.0，說(shuō)明樣品基本沒(méi)有降解，且不受蛋白或苯酚等污染[16]；A260/A230大于2，說(shuō)明樣品較少受多酚、多糖、有機(jī)溶劑等污染[14]。從表2 可以看出，試劑盒C 提取的葡萄總RNA質(zhì)量濃度均小于10 ng/μL，得率僅有1.5 μg/g 左右，A260/A280小于1.8 且A260/A230遠(yuǎn)小于2，說(shuō)明此法RNA 得率低，難以避免其他雜質(zhì)的污染。用改良CTAB 法提取的葡萄總RNA 質(zhì)量濃度均大于400 ng/μL，得率均大于85 μg/g，A260/A280在1.8～2.0 且A260/A230大于2，結(jié)果表明，該改良CTAB法提取效率高，所提RNA質(zhì)量良好，質(zhì)量濃度能夠滿足后續(xù)反轉(zhuǎn)錄的需求。

表2 不同提取方法得到葡萄果皮總RNA的質(zhì)量Tab.2 The quality of total RNA extracted from grape skins by different methods

2.3 RT-PCR 和qRT-PCR 擴(kuò)增檢測(cè)RNA 的有效性

將改良CTAB法提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并利用RT-PCR 和qRT-PCR 驗(yàn)證其可用性。不同貯藏時(shí)期葡萄的cDNA 模板均成功擴(kuò)增出了包括內(nèi)參基因在內(nèi)的6 個(gè)基因，條帶清晰單一，大小與預(yù)期一致（圖2-A）。同時(shí)，進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增后都能出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，且融解曲線為單峰（圖2-B、C），結(jié)果表明，改良CTAB 法得到的RNA 質(zhì)量良好，能夠用于RT-PCR和qRT-PCR分析。

2.4 VvMYBPA1基因CDS的擴(kuò)增結(jié)果

獲得基因完整的編碼序列是研究基因功能的重要前提。VvMYBPA1基因CDS的擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，以獲得的不同貯藏時(shí)期的葡萄cDNA 為模板，均成功擴(kuò)增出了目的片段，其大小約為1 000 bp，與預(yù)計(jì)的片段大小861 bp 接近。測(cè)序結(jié)果顯示，該片段為VvMYBPA1的CDS全長(zhǎng)序列，表明本研究建立的改良CTAB法提取的RNA完整性較好，可用于葡萄基因CDS的擴(kuò)增。

3 結(jié)論與討論

RNA 的提取是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。葡萄因富含多糖、多酚類物質(zhì)，難以獲取高質(zhì)量的RNA，尤其是在成熟葡萄果實(shí)中，這一難題限制了許多研究人員。本研究建立了一種簡(jiǎn)便易行、效果良好的總RNA提取方法，有效解決了從富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)的成熟葡萄果實(shí)中提取總RNA的難題。

葡萄作為一種漿果型水果，用于鮮食、釀酒、榨汁、晾干等，果實(shí)品質(zhì)直接影響著其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育和成熟，果實(shí)中積累了豐富的糖類、花青素、單寧等風(fēng)味物質(zhì)[17-18]。而在采后貯藏過(guò)程中，SO2類保鮮劑能夠有效延緩葡萄果實(shí)的生理衰老[4]，迄今為止的研究還沒(méi)有找到更好的保鮮方式。因此，提取葡萄果實(shí)的RNA 以研究果實(shí)品質(zhì)形成、采后生理和保鮮機(jī)制十分必要。

為獲得高質(zhì)量的葡萄果實(shí)總RNA，國(guó)內(nèi)外研究人員陸續(xù)進(jìn)行了一些嘗試?；诔Ｒ?guī)RNA 提取方法，通過(guò)調(diào)整乙醇、醋酸鉀、PVP、β-巰基乙醇等關(guān)鍵藥品的添加時(shí)間和添加劑量，成功提取出了毛葡萄[19]、黑皮諾[10]、山葡萄[20]等品種的果實(shí)總RNA。其中，改進(jìn)后的CTAB 法RNA 得率最高。與之相比，本研究建立的改良CTAB 法中減少了山梨醇洗液清洗、醋酸鉀沉淀、氯化鋰沉淀、DNase 處理等步驟，在減少操作時(shí)間的同時(shí)降低了提取成本；在提取緩沖液中增加了亞精胺和PVP，提高了RNA的質(zhì)量濃度和純度。本研究建立的改良CTAB 法RNA產(chǎn)率均在85 μg/g 以上，RNA 樣品純度高、完整性好，成功檢測(cè)了葡萄內(nèi)參基因和5個(gè)病程相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄，結(jié)果與前人一致[4，21]，也成功用于CDS的擴(kuò)增，為相關(guān)研究提供了前期基礎(chǔ)。

我們嘗試用試劑盒提取，按照操作指南3種不同試劑盒均沒(méi)有得到可用的玫瑰香葡萄果實(shí)總RNA，包括聲稱適用于植物組織的TransZolPlant和適用于水果組織的RibospinTMSeed/Fruit。而本研究建立的改良CTAB法既能得到高質(zhì)量的總RNA，還降低了試驗(yàn)成本。

本研究所建立的改良CTAB 法的裂解液中包括CTAB、PVP、亞精胺、β-巰基乙醇及高濃度的NaCl。亞精胺作為RNase 抑制劑，有效地保證了RNA 的完整性[22-23]?？扇苄訮VP 能與酚類物質(zhì)充分結(jié)合形成螯合物[24]，并通過(guò)氯仿抽提將其除去，有效阻止了多酚的干擾[11]。同時(shí)，在預(yù)熱的提取液中加入強(qiáng)還原劑β-巰基乙醇，可與PVP 協(xié)同作用抑制酚類物質(zhì)的氧化[25-26]。提取液中NaCl 的濃度為2.5 mol/L，較高的鹽濃度會(huì)造成溶解度差異，使CTAB 與多糖形成復(fù)合物沉淀，從而有效去除多糖[27]。同時(shí)，利用酸性水飽和酚純化核酸粗提物，RNA 被分配于水相，DNA 和蛋白質(zhì)被分配于有機(jī)相[28]，既能最大限度地去除與RNA 共沉淀的DNA，又能清除殘留的蛋白質(zhì)與多糖。

此外，用本研究報(bào)道的改良CTAB 法從玫瑰香葡萄花蕾、幼葉、成熟葉片及成熟紅提葡萄果實(shí)中提取到了高質(zhì)量的RNA[29]。說(shuō)明本方法適用于不同品種葡萄的多種組織，但是否適用于其他多酚、多糖的植物組織材料，仍需要繼續(xù)驗(yàn)證。

總之，本試驗(yàn)所建立的RNA 提取方法成本低、穩(wěn)定性好，所得樣品純度高、完整性好，適用于后續(xù)RT-PCR、qRT-PCR、CDS 擴(kuò)增等工作，是一種理想的提取葡萄成熟果實(shí)總RNA的方法。