申慧敏，吳年隆，王亞敏，王興春

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，山西 太谷 030801）

光在植物生長發(fā)育各個階段起重要的調(diào)控作用，植物中諸如種子萌發(fā)、向光性生長、光呼吸和光合作用等生理生化現(xiàn)象都與其密切相關(guān)。植物通過光受體感知光信號，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)基因表達，控制細(xì)胞分裂、分化與生長，最終調(diào)控器官發(fā)育和形態(tài)建成，其中，光受體在這個過程中起重要調(diào)節(jié)作用[1]。光敏色素是一類能吸收紅光與遠(yuǎn)紅光，且可相互轉(zhuǎn)化的色素蛋白，可分為光不穩(wěn)定型的類型Ⅰ光敏色素（typeⅠphytochrome，PⅠ）和光穩(wěn)定型的類型Ⅱ光敏色素（typeⅡphytochrome，PⅡ），無論是單子葉植物還是雙子葉植物，PⅠ由PHYA編碼，PⅡ由非PHYA的光敏色素基因編碼[2]。研究表明，光敏色素與植物的避陰反應(yīng)和抽穗開花期相關(guān)，此外，光敏色素還參與了形態(tài)建成、誘導(dǎo)多種酶的合成、植物激素代謝等生理過程[3-5]。

光敏色素存在植物的各個組織中，生理作用廣泛，調(diào)節(jié)植物從生長發(fā)育到衰老的形態(tài)建成。近年來，光敏色素的功能相繼被解析出來。啟動光敏色素信號的第1 步是通過PHYA 感知遠(yuǎn)紅光或PHYB-PHYE 感知紅光來改變Pr 和Pfr 的構(gòu)象，光活化后，光敏色素從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[6-7]。激活后的光敏色素復(fù)合體與下游作用因子PIFs 和COP1-SPA相互作用[8]。PIFs是bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在光敏色素介導(dǎo)的信號網(wǎng)絡(luò)中起樞紐作用[9]，光敏色素與核內(nèi)的PIFs 相互作用，誘導(dǎo)PIFs 磷酸化，并通過泛素26S 蛋白酶降解蛋白，因此，光敏色素通過降解光形態(tài)發(fā)生的負(fù)調(diào)控因子PIFs 來介導(dǎo)光形態(tài)發(fā)育[10]。此外，KOZUKA等[11]研究發(fā)現(xiàn)，光敏色素通過協(xié)調(diào)油體脂質(zhì)的降解及其代謝產(chǎn)物糖的產(chǎn)生，參與去黃化過程中子葉變綠過程，在植物去黃化過程中起到關(guān)鍵作用。LI 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，玉米中的ZMPYC1和ZMPYC2基因可調(diào)控植株開花時間和株型結(jié)構(gòu)，為耐密玉米品種的選育提供了新思路和理論基礎(chǔ)。XIN 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，光敏色素信號（SFPS）剪接因子能與光受體光敏色素B 直接相互作用響應(yīng)光信號，通過調(diào)控光信號AAA 傳導(dǎo)和晝夜節(jié)律基因mRNA 前體的剪接來調(diào)節(jié)光介導(dǎo)的植物發(fā)育過程。

谷子（Setaria italica）是世界上最古老的馴化作物之一，與其他作物相比，其具有許多優(yōu)良性狀，包括抗旱、耐貧瘠，C4高光效，在旱作可持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)中具有重要作用[14-16]。然而，鮮見有關(guān)對SiPHY基因家族成員及功能的研究報道。

本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定分析谷子中PHY基因家族成員及其在不同光周期條件下的表達模式，有助于研究光敏色素與谷子光敏感性間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料有野生型晉谷21、黃粟、大同紅谷和早熟突變體xiaomi（晉谷21 的EMS 誘變突變體）、xiaomi3（黃粟的自然誘變突變體）、xiaomi4（大同紅谷的自然誘變突變體）。

1.2 試驗方法

1.2.1SiPHY基因家族序列鑒定及理化性質(zhì)分析從擬南芥（Arabidopsis thaliana）數(shù)據(jù)庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中獲得5個PHY家族成員（At-PHY）的蛋白序列，在Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中下載水稻、高粱、玉米和狗尾草的基因組數(shù)據(jù)，在谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（http://sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm）下載谷子xiaomi的基因組數(shù)據(jù)。利用擬南芥AtPHY 蛋白序列通過Bio Edit 軟件中的Local BLAST 程序篩選xiaomi、水稻、高粱、玉米和狗尾草的PHY 蛋白序列，篩選不穩(wěn)定條件為E-value＜10e-10，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）進行結(jié)構(gòu)域驗證。最后利用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）對谷子SiPHY 蛋白的氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量、等電點（PI）、不穩(wěn)定系數(shù)和脂肪系數(shù)等理化性質(zhì)進行預(yù)測。

1.2.2SiPHY基因家族進化分析 將1.2.1 中篩選鑒定到的谷子、擬南芥、水稻、高粱、玉米和狗尾草的PHY基因，利用MEGA 7.0 軟件中的Align By Muscle 程序?qū)? 種不同物種的PHY 家族成員的蛋白序列進行多序列比對，并采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000。

1.2.3SiPHY基因家族的保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析 使用在線網(wǎng)站MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測谷子SiPHY基因的保守基序，Motif數(shù)目設(shè)置為10，然后利用TBtools 繪制xiaomiPHY家族基因的基因結(jié)構(gòu)和保守基序圖。

1.2.4SiPHY啟動子順式作用元件分析 在谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫下載谷子PHY 家族各成員的上游2 000 bp 的基因組序列，然后遞交至在線網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件分析；最后利用TBtools 對整理后的功能元件進行可視化操作。

1.2.5 不同光周期下SiPHY基因的表達模式分析利用谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫中的Expression Visualization 工具獲取SiPHY基因的表達量及熱圖，并對其表達譜進行分析。為進一步研究在不同光周期條件下SiPHY基因的表達情況，本研究選用在長日照條件（16 h 光照，28 ℃/8 h 黑暗，22 ℃）和短日照條件（10 h 光照，14 ℃/8 h 黑暗，22 ℃）生長30 d 的野生型晉谷21、黃粟、大同紅谷和早熟突變體xiaomi、xiaomi3、xiaomi4的新生葉，用熒光定量PCR（qRTPCR）的方法檢測SiPHY基因的表達量。材料種植于恒溫培養(yǎng)箱中，光照強度設(shè)置為30 000 lx，濕度設(shè)置為50%，每7 d澆一次B5營養(yǎng)液。

采用Omega 植物RNA 提取試劑盒R6827-01提取6個品種新生葉片的RNA，采用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit（貨號RR047A）合成cDNA 第一鏈，TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（貨號RR820A）進行實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR），3次生物學(xué)重復(fù)。15 μL反應(yīng)體系包括：7.5 μL 2×Taq PCR Master Mix（含熒光染料）、10 μmol/L 上下游引物各0.6 μL、3.3 μL ddH2O 和3 μL cDNA模板。反應(yīng)條件為：95 ℃2 min；95 ℃5 s，60 ℃30 s，39 個循環(huán)。RT-qPCR 引物序列信息如表1 所示。以內(nèi)參基因Si9g37480為對照，該基因在谷子的11個組織中表達量穩(wěn)定。利用公式2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

表1 SiPHY實時熒光定量PCR分析引物Tab.1 SiPHY real-time fluorescence quantitative PCR analyze primers

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用BioRad CFX Manager 軟件將4個SiPHY基因的RT-qPCR 數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Excel，將重復(fù)性差的數(shù)據(jù)刪除，計算出各基因的平均Cq值和相對表達量，將數(shù)據(jù)整理后采用SPSS 軟件進行分析，并在Excel中作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiPHY基因家族的鑒定及其理化性質(zhì)分析

通過同源序列比對，在谷子xiaomi的PHY家族基因包含4個基因，分別命名為：SiPHY-1、SiPHY-2、SiPHY-3和SiPHY-4，均包含PHY（PF00360）、PAS（PF00989）和GAF（PF01590）結(jié)構(gòu)域，其中，PAS 和GAF形成光感受中心，能夠調(diào)節(jié)發(fā)色團的裝配和改變突變蛋白的光譜特性[17]，PHY結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)光敏色素Pfr 形態(tài)穩(wěn)定性的微調(diào)和保證正確的光譜特性、核定位、激酶活性具有重要意義[18-19]。SiPHY-1、SiPHY-3和SiPHY-4分布在9號染色體上，SiPHY-2分布在8號染色體上；cDNA長度為2 373～3 519 bp，編碼790～1 172個氨基酸；分子質(zhì)量在87 118.83～128 453.27 u，等電點在5.81～6.27，除SiPHY-2 外，其余3 個成員親水性（GRAVY）均為負(fù)數(shù)，表明它們均屬于酸性親水性蛋白（表2）。

表2 SiPHY基因家族成員基本信息Tab.2 Basic information of SiPHY gene family members

2.2 谷子、水稻、擬南芥、高粱、玉米和狗尾草PHY家族基因的進化分析

為研究谷子SiPHY的進化關(guān)系，將擬南芥（5個）和水稻（3個）、高粱（3個）、狗尾草（3個）、玉米（6個）以及谷子（4個）PHY 家族基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖1 所示，4 個SiPHY 分別屬于PHYA、PHYB、PHYC 等3個亞族，其中，SiPHY-1和SiPHY-2屬于PHYA 亞族，SiPHY-3 屬于PHYB 亞族，SiPHY-4 屬于PHYC 亞族，且PHYA 亞族聚為一支，PHYB 和PHYC 聚在一起。結(jié)果表明，谷子SiPHY 與狗尾草SvPHY、高粱SbPHY、玉米ZmPHY、水稻OsPHY 的親緣關(guān)系近于與擬南芥AtPHY 的親緣關(guān)系。這可能是因為谷子、狗尾草、水稻、高粱、玉米是單子葉禾本科植物，而擬南芥屬于雙子葉十字花科植物，推測植物在進化過程中PHY基因發(fā)生了生物學(xué)功能分化。

2.3 SiPHY基因家族的保守域和基因結(jié)構(gòu)分析

為進一步了解谷子SiPHY家族成員的功能，對谷子SiPHY家族基因成員進行保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖2所示，SiPHY家族成員被分為2 個亞族，4 個SiPHY基因均為斷裂基因，且基因結(jié)構(gòu)均存在一定的差異。SiPHY-1和SiPHY-3含有5′端非翻譯區(qū)和3′端非翻譯區(qū)。SiPHY-4中間存在一段較長的內(nèi)含子區(qū)域，可能在谷子生長發(fā)育中起特殊作用。

對谷子SiPHY蛋白的保守基序進行分析發(fā)現(xiàn)，總共鑒定了10個具有24～50個氨基酸殘基的保守基序?；騇otif 1～Motif 10 存在于SiPHY-1、SiPHY-2 和SiPHY-3 中，SiPHY-4 中沒有Motif 10。4 個SiPHY 家族成員Motif 的排布順序相同且位置相近，表明谷子SiPHY基因家族成員的保守性較高，這些保守的Motif 在谷子光形態(tài)建成中提供了重要保障。

2.4 SiPHY基因家族的啟動子順式作用元件分析

為深入了解谷子SiPHY基因家族基因成員的潛在功能，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對啟動子的順式作用元件進行分析，結(jié)果如圖3 所示，共篩選鑒定出66種順式作用元件，主要與光響應(yīng)、激素和逆境脅迫有關(guān)。其中，光響應(yīng)元件包括AE-box、L-box、ATC-motif、GT1-motif、G-box、MRE、circadian 和ACE等，激素響應(yīng)元件包括生長素響應(yīng)元件（TGAelement、AuxRR-core）、赤霉素響應(yīng)元件（GAREmotif、P-box、TATC-box）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）和水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）等，此外，還包括干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）及參與防御和應(yīng)激響應(yīng)元件（TC-rich repeats）等。其中，SiPHY-1基因中含有的響應(yīng)元件最多，有38種，SiPHY-2基因中含有的響應(yīng)元件最少，有28 種，推測谷子中的PHYA 亞族中SiPHYA-1起主要作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，光響應(yīng)元件在4 個谷子SiPHY家族基因成員中所占的比例最多，分別占26.32%（SiPHY-1）、21.43%（SiPHY-2）、21.21%（SiPHY-3）和18.92%（SiPHY-4）。這些結(jié)果表明，谷子SiPHY基因的表達主要受光信號的調(diào)節(jié)，在光形態(tài)建成中有重要作用，其次在抗逆脅迫中也發(fā)揮著作用。

2.5 不同光周期下SiPHY基因的表達模式分析

為探究SiPHY基因在谷子不同組織的表達模式，利用谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫中xiaomi的11 個組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制SiPHY基因表達熱圖，結(jié)果如圖4 所示。除了SiPHY-2外，其余3 個SiPHY在11 個組織中均有表達。其中，SiPHY-1在萌發(fā)3 d 的種子中表達量最高，在其他10 個組織中表達量趨于一致，推測其在谷子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用；SiPHY-2在11個組織中表達量均很低，在有的組織中表達量甚至為0；SiPHY-3和SiPHY-4在灌漿期的莖中表達量最高，其次在灌漿期的穗和旗葉中表達量較高，推測其在谷子灌漿期發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明，光敏色素基因參與調(diào)控了谷子生長發(fā)育中的各個時期，并在種子萌發(fā)、抽穗期和灌漿期中發(fā)揮重要作用。

利用在長日照條件（LDs）和短日照條件（SDs）生長30 d 的野生型晉谷21、黃粟、大同紅谷和突變體xiaomi、xiaomi3、xiaomi4的新生葉，用qRT-PCR方法分析SiPHY基因在不同光周期下的表達量，結(jié)果如圖5 所示。從圖5可以看出，SiPHY基因在不同光周期下的6 個谷子品種中的表達模式均有差異，SiPHY-2在6 個谷子品種中均微量表達或不表達。晉谷21 中的SiPHY-1在不同光周期下的表達量有明顯差異；xiaomi、黃粟、xiaomi3中的SiPHY-4在不同光周期下的表達量有明顯差異；大同紅谷中的SiPHY-3在不同光周期下的表達量有明顯差異。這些結(jié)果表明，光周期影響谷子光敏色素的表達，不同品種的表達模式不同，光敏色素在谷子光形態(tài)建成中的作用還需進一步探究。

3 結(jié)論與討論

植物對光信號的感受是通過4 類光受體來實現(xiàn)的：感受紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素（Phytochrome，PHY）、感受藍光和紫外光的隱花色素（Cryptochrome，CRY）、藍光依賴的向光蛋白（Photochopin，PHOT）和UVB 受體。光敏色素是由多基因編碼，屬小基因家族，不同植物體內(nèi)的家族成員和拷貝數(shù)不同。擬南芥種存在PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5種光敏色素[20]，而在禾本科植物水稻、玉米和小麥中只存在PHYA、PHYB 和PHYC 等3 種光敏色素，不同的是水稻中的光敏色素是單拷貝，玉米為雙拷貝，小麥為三拷貝[21]。而谷子基因組中只有4個光敏色素基因：PHYA（SiPHY-1和SiPHY-2）、PHYB（SiPHY-3）和PHYC（SiPHY-4）。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中光敏色素介導(dǎo)的光信號與脫落酸代謝途徑相互作用，光敏色素作用因子PIFs也參與了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。對谷子光敏色素家族基因啟動子進行順式作用元件分析，共鑒定出66 種順式作用元件，其中，光響應(yīng)元件和激素類響應(yīng)元件最多，表明谷子光敏色素受光和激素的調(diào)節(jié)。

植物光敏色素廣泛存在于包括根在內(nèi)的所有組織中，幾乎調(diào)節(jié)植物生命周期的每個過程。其中，PHYA負(fù)責(zé)感知遠(yuǎn)紅光，PHYB-PHYE參與紅光介導(dǎo)的光形態(tài)發(fā)育[23]。PHYA對種子萌發(fā)具有促進或抑制作用，參與去黃化作用，促進開花和重置生物鐘，調(diào)控根的發(fā)育，調(diào)節(jié)特化的韌皮部細(xì)胞從暗向光形態(tài)發(fā)生過渡，參與芽休眠及花的形態(tài)發(fā)生等[24]；PHYB 能與IAA14、ARF7 以及ARF9 互作，這些互作能夠穩(wěn)定IAA14 蛋白，抑制ARF7 和ARF19的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制黑暗誘導(dǎo)下胚軸不定根的形成[25]。YANG 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，xiaomi早抽穗表型是由于PHYC基因第2 外顯子上G→T 突變引起的。此外，PHYD與植物避陰性反應(yīng)相關(guān)，PHYE與種子萌發(fā)和避陰性反應(yīng)相關(guān)[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，SiPHY-1在萌發(fā)3 d的種子中表達量最高，推測其可能與種子萌發(fā)有關(guān)；SiPHY-2在各個時期表達量均很低，推測谷子中的2個PHYA基因中SiPHY-1起主要作用；SiPHY-3在灌漿期的莖、旗葉和穗中表達量較高，推測SiPHY-3與谷子形態(tài)建成有關(guān)。SiPHY在不同光周期條件下的表達譜顯示，SiPHY-1、SiPHY-3和SiPHY-4在長日照和短日照條件下都表達，不同材料的表達量有明顯差異。SiPHY-1在晉谷21和大同紅谷中差異顯著，SiPHY-3在大同紅谷中差異顯著，SiPHY-4在晉谷21、xiaomi、黃粟和xiaomi4中差異顯著。PHYA-2在不同材料和光周期條件下均微量表達或不表達，表明光周期參與調(diào)控光敏色素，不同材料對光敏色素的敏感性不同。光敏色素在谷子生長發(fā)育中的作用還需進一步研究。

本研究通過生物信息學(xué)的方法共鑒定出4 個SiPHYs，分布在8 號（1 個）和9 號（3 個）染色體上，均包含PHY（PF00360）、PAS（PF00989）和GAF（PF01590）結(jié)構(gòu)域，與PHY 家族基因的結(jié)構(gòu)域一致。不同谷子SiPHY蛋白的理化性質(zhì)存在差異，但均為親水性蛋白。谷子SiPHY 與狗尾草SvPHY 親緣關(guān)系最近，與擬南芥AtPHY 親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。SiPHY啟動區(qū)存在光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件等。表達譜分析結(jié)果推測，SiPHY可能與谷子的種子萌發(fā)、形態(tài)建成和抽穗開花期有關(guān)。SiPHY表達量受光周期和基因型的影響，SiPHY-2在不同光周期和不同材料中表達量均很低或不表達，推測谷子中的2 個SiPHYA只有一個發(fā)揮作用。這些結(jié)果為之后谷子中光敏色素的研究奠定了基礎(chǔ)，也為解析光敏色素是如何參與谷子光形態(tài)建成提出了理論依據(jù)。