張 蕊， 石 娜， 孫玲凌， 李 藝

(周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程學(xué)院，河南周口 466000)

我國自20 世紀(jì) 70 年代開展植物組織培養(yǎng)研究以來，組培技術(shù)在觀賞植物研究中得到了廣泛的應(yīng)用，為優(yōu)質(zhì)植物苗木的繁育和工廠化苗木的生產(chǎn)提供了可靠技術(shù)。但由于組培苗技術(shù)存在培育周期長、對無菌環(huán)境要求高、培養(yǎng)過程易污染、組培苗移栽成活率低等不足，使組培技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用受到一定限制。20世紀(jì)80年代末日本學(xué)者古在豐樹教授提出了無糖組織培養(yǎng)技術(shù)，人工控制培養(yǎng)條件，特別是在高濃度CO和高光照度的條件下，利用植物自身光合作用合成的碳源為植物自身的生長提供有機(jī)物質(zhì)，而去除培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)，因此減少了培養(yǎng)基污染的機(jī)會，因而能在開放條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由于無糖組織培養(yǎng)技術(shù)中植物的生長環(huán)境更接近自然環(huán)境，因而無糖組培苗移栽減少了訓(xùn)化時間，縮短了育苗周期，并提高了移栽成活率。目前國內(nèi)外在棗、核桃、毛白楊、棕櫚、咖啡、桉樹、葡萄、萬年青等植物上都有報(bào)道。

植物光自養(yǎng)微繁培養(yǎng)苗木需要特殊的容器，操作要求相對嚴(yán)格，投資成本較高，目前主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室范疇，生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用較?。荒壳瓣P(guān)于楸樹組培技術(shù)的報(bào)道較多，但國內(nèi)外尚未有關(guān)于楸樹的無糖組培技術(shù)報(bào)道。本試驗(yàn)以周楸帶葉柄葉片為外植體，研究葉柄部位在不同光照度、基本培養(yǎng)基和外源激素下誘導(dǎo)生根和腋芽再生植株的最適培養(yǎng)條件，在近常規(guī)環(huán)境下利用葉片進(jìn)行根誘導(dǎo)和植株再生，旨在為楸樹優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試楸樹葉片采集于河南省周口市河南花博士花卉有限公司楸樹種植基地。

試驗(yàn)于2020年5月5日在基地采集發(fā)育成熟、生長健壯的功能期葉片，用鋒利的刀片徒手沿葉柄基部將葉片從母株上切割下來，切割下來的葉片要完整，保留葉片和葉柄及葉柄基部部分木質(zhì)部組織，同時要注意保留葉柄基部的腋芽，然后對離體材料的葉柄進(jìn)行處理使分生組織外露；將葉片及葉柄在自來水下沖洗5min，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗，70%乙醇浸泡30 s后，接種到種子發(fā)芽盒中進(jìn)行水培培養(yǎng)；2020年6月14日栽培到容器中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)光照度設(shè)2個水平：3 000、5 000 lx；Hogland培養(yǎng)液濃度設(shè)2種水平：1/2Hogland+1%大蒜素、1/4Hogland+1%大蒜素；植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸(NAA)、細(xì)胞分裂素(6-BA) 分別設(shè)4個水平：NAA(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)；6-BA(0、0.2、0.4、0.8 mg/L)共計(jì)64個處理。

試驗(yàn)在普通組培室進(jìn)行，所用種子發(fā)芽盒為 13×19×12 cm透明塑料種子發(fā)芽盒，每個處理培養(yǎng)葉片10張，每盒2張葉片；水培培養(yǎng)介質(zhì)為高密度無土栽培水培植物專用泡沫板。

接種前對組培室進(jìn)行紫外線滅菌處理，種子發(fā)芽盒、自封袋和泡沫板進(jìn)行紫外線處理后，再用無水乙醇處理30 min。所用培養(yǎng)液進(jìn)行高壓滅菌處理。培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，光照時間為10 h/d，12絲自封袋密封保濕培養(yǎng)3 d，然后打開自封袋口培養(yǎng)，待組培苗生根后去除自封袋，在開放環(huán)境進(jìn)行生長，生根后移栽到容器中培養(yǎng)為獨(dú)立植株。

1.3 觀察記錄與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

5 d后觀察愈傷組織、根系、腋芽形成及生長情況，記錄開始生根時間，培養(yǎng)40 d時統(tǒng)計(jì)生根率、腋芽高度、植株干質(zhì)量和愈傷組織黏化葉片數(shù)目：計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)全部試驗(yàn)處理生根情況，然后計(jì)算生根率；腋芽高度為植株基部至主莖頂部的距離，測量全部試驗(yàn)處理已發(fā)芽的植株高度，然后計(jì)算不同光照度(3 000、5 000 lx)、不同培養(yǎng)液濃度(1/2Hogland+1%大蒜素、1/4Hogland+1%大蒜素)條件下植株的平均高度；植株干質(zhì)量測定為隨機(jī)抽取1個不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的試驗(yàn)處理(NAA 0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L)，然后分別統(tǒng)計(jì)該處理在不同光照度(3 000、5 000 lx)、不同培養(yǎng)液濃度(1/2Hogland+1%大蒜素、1/4Hogland+1%大蒜素)條件下，去除葉柄后的再生植株的干質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照度對楸樹葉片生根率、腋芽高度和植株干質(zhì)量的影響

光照為綠色植物光合作用提供能源，是植物進(jìn)行光合作用的必要條件，在光照度達(dá)到光飽和點(diǎn)之前，隨著光照度增加，光合速率提高，大多數(shù)木本植物陽生葉片光補(bǔ)償點(diǎn)為1.0～1.5 klx，光飽和點(diǎn)為20～50 klx。從表1可以看出，楸樹離體葉片在光照度5 000 lx時葉片的生根率、腋芽高度和再生植株干質(zhì)量均高于處理3 000 lx，但差異不顯著。

表1 光照度對楸樹葉片生根率、腋芽高度和植株干質(zhì)量的影響

肉眼觀察比較不同光照度下根系和腋芽生長情況亦無顯著差異，盡管高光強(qiáng)可以提高楸樹葉片的光合速率，為楸樹植株再生合成更多有機(jī)物質(zhì)，但試驗(yàn)結(jié)果表明，光照度3 000 lx條件下植物光合作用合成的有機(jī)物即可滿足楸樹葉片植株再生需求。

2.2 不同濃度培養(yǎng)液對楸樹葉片生根率、腋芽高度和植株干質(zhì)量的影響

離體楸樹葉片維持生存并進(jìn)行植株再生，需要利用葉柄從培養(yǎng)液吸收水分和所必需的礦物質(zhì)來參與調(diào)節(jié)生命活動。從表2可以看出，離體楸樹葉片對培養(yǎng)液中無機(jī)鹽要求濃度較低，其生根率和植株干質(zhì)量在1/4 Hogland培養(yǎng)液濃度下表現(xiàn)均優(yōu)于1/2Hogland培養(yǎng)液，但二者無顯著差異。在1/2 Hogland培養(yǎng)液中，愈傷組織褐化或發(fā)黏個體數(shù)比較多，愈傷組織生長緩慢甚至停止，愈傷組織遲遲不生根，而進(jìn)一步影響葉片植株再生；1/2 Hogland培養(yǎng)液中黏化比例達(dá)15.00%，1/4 Hogland培養(yǎng)液中黏化比例則為8.13%，2種不同濃度培養(yǎng)液中愈傷組織黏化植株數(shù)目差異顯著(表2、圖1)。

表2 不同培養(yǎng)液濃度對楸樹葉片生根率、植株干質(zhì)量和愈傷組織黏化的影響

2.3 不同組合外源激素對楸樹葉片生根時間、生根率和腋芽高度的影響

由表3可知，當(dāng)培養(yǎng)液中不含NAA，外源激素 6-BA 含量為0～0.4 mg/L時， 楸樹葉片生根率和腋芽高度均隨著6-BA濃度的增加而增加；隨著培養(yǎng)液中NAA濃度的增加，楸樹葉片生根和生長所需最適的6-BA濃度逐漸降低。培養(yǎng)液中NAA與 6-BA 不同組合中，NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L和NAA 0.4 mg/L+6-BA 0 mg/L 3個處理中，植株生根率可達(dá)90%及以上；腋芽高度在NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.4 mg/L、NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L及NAA 0.2 mg/L、NAA 0.4 mg/L與6-BA不同濃度組合的處理中均表現(xiàn)較好長勢，植株高度均在 3.00 cm 以上。

表3 不同組合外源激素對楸樹葉片生根率和腋芽高度的影響

從表4可知，在楸樹葉片培養(yǎng)中，NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L組合，愈傷組織培養(yǎng)5 d出現(xiàn)，出現(xiàn)早且生長快，提高NAA濃度，愈傷組織出現(xiàn)時間反而較晚；NAA 0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L 組合和NAA 0.4 mg/L+6-BA 0 mg/L 組合最早生根，低濃度NAA培養(yǎng)液中，愈傷組織需要較長時間的培養(yǎng)才能生根。

表4 不同組合外源激素對楸樹葉片愈傷組織出現(xiàn)時間和生根時間的影響

培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在較低NAA和適當(dāng)6-BA的條件下，離體楸樹葉片往往先長出腋芽，而后生根形成植株(圖2)。當(dāng)培養(yǎng)液中NAA濃度較高而 6-BA 濃度較低時生根則更容易(圖3)。

2.4 移栽條件及管理措施

將培養(yǎng)40 d生根的離體楸樹葉片移栽到園土 ∶草炭土=4 ∶1的基質(zhì)中，然后室外遮陰培養(yǎng)，白天由于氣溫高、天氣炎熱要注意多人工灑水降溫、增加空氣濕度。移栽時可帶腋芽移栽，腋芽直接發(fā)育成植株(圖4-a)；移栽時如切去腋芽，在移栽后3 d左右陸續(xù)發(fā)芽，且誘導(dǎo)芽發(fā)育整齊，生長快(圖4-b)。

3 討論與結(jié)論

具有一定面積含有葉綠素的葉片能獨(dú)立進(jìn)行光合作用，從而合成植物生長所需的有機(jī)化合物。無糖組培利用綠色植物通過光合作用合成植物生長所必需的碳水化合物，在光合速率達(dá)到飽和前，光照度制約光合作用，通常2 000～3 000 lx的光照度可滿足外植體光合作用和對光通量的需求，如周鍾信等在對非洲菊再生小莖芽無糖組培培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，2 800、8 000 lx光照度對試驗(yàn)結(jié)果無明顯影響，認(rèn)為過度提高光照度會因過多消耗而提高育苗成本。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，離體楸樹葉片培養(yǎng)40 d時的生根率、再生腋芽株高及再生植株的干質(zhì)量在 5 000 lx 條件下高于3 000 lx，但差異不顯著，表明光照度在3 000 lx下，離體楸樹葉片合成的碳水化合物等有機(jī)物即可以滿足植株再生的要求，這可能與楸樹葉片為發(fā)育成熟的葉片，光合面積比較大、光合效率較高，組培室采光比較好，培養(yǎng)環(huán)境更接近自然光照條件有關(guān)。這為下一步研究如何更有效地利用人工光源對培養(yǎng)過程進(jìn)行補(bǔ)光，楸樹葉片培養(yǎng)過程中對不同波長光的吸收利用及光周期對根和芽誘導(dǎo)的影響提供了一定的思路。葉片的光合作用不僅能為芽、莖、切口發(fā)育源源不斷地提供碳水化合物，而且葉片自身產(chǎn)生的內(nèi)源激素及其他生根促進(jìn)物，更有利于楸樹離體葉片發(fā)育成再生植株。

土壤中的礦質(zhì)元素必須溶于水才能被植物根系吸收，在植物組織培養(yǎng)中常用瓊脂作為支撐材料，因其透氣性和營養(yǎng)元素移動性差等原因而造成組培苗根系發(fā)育慢。采用塑料泡沫、巖棉、蛭石、珍珠巖等多空材料代替瓊脂等凝膠類物質(zhì)可通過改善根系生長環(huán)境而促進(jìn)根系和組培苗的生長，同時固體基質(zhì)對營養(yǎng)元素的濃度具有一定的緩沖作用，營養(yǎng)元素通過水分逐漸被植物根系吸收一部分，而大部分會隨著水分流失；而水培能極大地節(jié)約人工，勞動強(qiáng)度小，避免營養(yǎng)元素流失，更適合立體栽培。本試驗(yàn)采用Hogland培養(yǎng)液，研究發(fā)現(xiàn)盡管離體楸樹葉片的生根率和再生植株干質(zhì)量在2種不同濃度的培養(yǎng)液條件下無顯著差異，但在1/2Hogland培養(yǎng)液條件下，離體楸樹葉片愈傷組織黏化植株的數(shù)量高于1/4Hogland培養(yǎng)液，差異達(dá)顯著水平，這可能與培養(yǎng)液中離子濃度過高有關(guān)。培養(yǎng)液中的各種營養(yǎng)元素全部溶解在水中，能及時被植物吸收利用，但在培養(yǎng)期間如果培養(yǎng)液中離子濃度超過植物器官忍耐程度，就會對新生長的愈傷組織產(chǎn)生毒害；同時由于楸樹葉面積比較大，對于N、P、K、Mg等易移動元素，可被運(yùn)輸?shù)缴L中心而被重復(fù)利用，能較大地滿足再生植株生長需要，所以在試驗(yàn)中1/4Hogland培養(yǎng)液綜合優(yōu)于1/2Hogland培養(yǎng)液，且節(jié)約了成本，避免資源浪費(fèi)。

植物生長調(diào)節(jié)劑在愈傷組織誘導(dǎo)、生長和分化中起重要作用，同一種植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度及不同植物生長調(diào)節(jié)劑的配比對愈傷組織的誘導(dǎo)和分化會產(chǎn)生不同影響，NAA 和6-BA不同濃度及 6-BA/NAA 不同比值在楸樹常規(guī)組培的近年研究報(bào)道較多。楊燕從篩選楸樹各種外植體入手，發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L NAA對楸樹無菌苗誘導(dǎo)生根效果最好；高濃度6-BA和高比值6-BA/NAA條件下形成的愈傷組織質(zhì)地緊密，但易褐變；低濃度 6-BA 和低比值6-BA/NAA條件下形成的愈傷組織質(zhì)地疏松，不易褐變，且容易分化不定根。楸樹無糖組培培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)NAA為 0.1 mg/L，同時6-BA為 0.2 mg/L時，離體楸樹葉片的葉柄愈傷組織出現(xiàn)最早，繼續(xù)提高NAA 和6-BA濃度，愈傷組織出現(xiàn)時間反而推遲，表明較低生長素和適當(dāng)細(xì)胞分裂素的條件下更加適合愈傷組織分化與生長。而相反當(dāng)培養(yǎng)液中不含6-BA，NAA濃度為0.2、0.4 mg/L時，離體楸樹葉片的葉柄最早出現(xiàn)不定根，表明較高生長素濃度和較低的細(xì)胞分裂素濃度時愈傷組織生根更容易。同時試驗(yàn)結(jié)果表明，楸樹無糖組織培養(yǎng)過程中所需NAA 和6-BA濃度比常規(guī)組織培養(yǎng)中所需濃度低，這可能與離體葉片能夠合成部分內(nèi)源激素有關(guān)，這為下一步對楸樹離體葉片無糖組織培養(yǎng)內(nèi)源激素及生理生化物質(zhì)變化研究明確了方向。

楸樹葉片誘導(dǎo)植株移栽后，去除原有腋芽的再生植株生長速度要快于保留腋芽的再生植株，且去除腋芽的再生植株的生長整齊度高，這可能與切去腋芽更有利于根系發(fā)育有關(guān)。腋芽的去除減少了地上部分營養(yǎng)成分的消耗，減輕了移栽初期根系的負(fù)擔(dān)，有益于移栽初期根系的發(fā)育。

綜上所述，本研究通過試驗(yàn)從2個光照度、2個Hogland培養(yǎng)液濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA 16個不同濃度組合的64個處理中篩選出較佳培養(yǎng)條件：3 000 lx、1/4Hogland、NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.4 mg/L、NAA 0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L。該培養(yǎng)方法可以在開放環(huán)境中進(jìn)行，利用離體楸樹葉片水培培養(yǎng)再生植株，操作流程簡化，節(jié)約成本，縮短了育苗周期，可為楸樹育苗生產(chǎn)技術(shù)提供一種新的方法。