李丹，朱麗霞，汪萌，李舟，席青松，靳鐳

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430000)

透明帶(zona pellucida，ZP)是由卵母細(xì)胞分泌的、包裹在卵母細(xì)胞表面的一層糖蛋白結(jié)構(gòu)，ZP由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4糖蛋白組成，并在受精過程中發(fā)揮著重要的作用。ZP基因突變會改變ZP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、引發(fā)空卵泡綜合征(empty follicle syndrome，EFS)，從而影響受精過程，最終導(dǎo)致女性不孕。本文分析了6例EFS或ZP異?；颊呓邮茌o助生殖技術(shù)助孕治療后的臨床特征及助孕結(jié)局，為女性不孕基因診斷和進(jìn)一步的臨床診療提供了新的依據(jù)。

一、資料與方法

1.研究對象：選取2015年1月至2020年3月于本院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET助孕治療的6例EFS或ZP異常患者為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡25～35歲；(2)因EFS或ZP異常而診斷為不孕癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：單純因HCG因素導(dǎo)致的EFS患者。

行IVF前患者配偶均進(jìn)行了男性精液常規(guī)檢測且參數(shù)正常。該研究得到同濟(jì)醫(yī)院倫理監(jiān)督委員會的批準(zhǔn)。

2.樣本采集及DNA提?。翰杉颊呒凹蚁党蓡T外周靜脈血2 ml，并用Cwbio Gel Extraction Kit試劑盒(北京康為)提取外周血基因組DNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.全外顯子組測序及數(shù)據(jù)分析：將基因組DNA打斷成隨機(jī)碎片，純化后進(jìn)行全基因組外顯子捕獲，采用Agilent SureSelect Human All Exon V4試劑盒(Agilent，美國)進(jìn)行外顯子組富集，使用HiSeq2000測序儀(Illumina，美國)進(jìn)行高通量測序，并使用Illumina base-calling軟件1.7處理原始圖像文件，最后結(jié)合NCBI CCDS(www. ncbi. nlm. nih. gov/CCDS/)、RefSeq(www. ncbi. nlm. nih. gov/refseq/)、Ensembl(www. ensembl. org)、Encode(www. encodeproject. org)、dbSNP 135(www. ncbi. nlm. nih. gov/SNP/)、HapMap(www. ncbi. nlm. nih. gov/hapmap/)、1000 Genome project(www. internationalgenome. org)等數(shù)據(jù)庫收錄的致病基因和變異的信息對檢出的變異進(jìn)行分析。

4.促排卵方案：采用GnRH激動劑方案、拮抗劑方案或者高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案進(jìn)行控制性促排卵。當(dāng)有3個卵泡直徑≥18 mm時，當(dāng)天22：00 pm肌肉注射HCG(艾澤，默克，美國)10 000 U，36 h后在陰道超聲監(jiān)測下穿刺取卵。

二、結(jié)果

1.患者的基本情況：納入本研究的6例患者來自5個獨(dú)立的家庭且均為原發(fā)不孕。大多數(shù)患者的卵母細(xì)胞由于ZP缺失而退化，導(dǎo)致在體外受精中難以獲取卵母細(xì)胞，臨床表現(xiàn)為EFS、無透明帶卵母細(xì)胞(ZFO)、薄透明帶卵母細(xì)胞(ZTO)(表1)。

表1 患者的基本情況

2.ZP基因突變位點(diǎn)：全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，6例患者染色體核型均為46，XX，其中，病例1與病例2是來自同一家庭的1對姊妹，經(jīng)基因檢測證實(shí)均為ZP1基因復(fù)合雜合突變[1]；病例3與病例6為ZP2基因復(fù)合雜合突變；病例4與病例5為ZP3基因雜合突變。6例患者ZP基因突變位置及位點(diǎn)見表2。

表2 患者ZP基因突變位點(diǎn)

3.促排卵方案及助孕結(jié)局：病例1采用促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑方案促排卵1個周期，共獲得5枚結(jié)構(gòu)不清晰的卵冠丘復(fù)合物(OCCs)，經(jīng)用透明質(zhì)酸酶去除周圍的卵丘細(xì)胞后未發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞。

病例2采用GnRH激動劑方案或拮抗劑方案促排卵2個周期，均未成功獲得OCCs。病例1和病例2均表現(xiàn)為EFS，均未移植、取消周期。

病例3采用拮抗劑或PPOS方案共促排卵4個周期。第1個周期行常規(guī)IVF，共獲OCCs 5枚，MⅡ卵5枚(2個無ZP，3個ZP極薄)，均未受精；其余3個周期改行ICSI，共獲OCCs 13枚，MⅡ卵9枚(ZP薄且卵周間隙大)，6枚卵母細(xì)胞正常受精，胚胎培養(yǎng)至第3天共冷凍6枚2級胚胎(細(xì)胞數(shù)6～10，碎片≤10%，卵裂球相對均勻)，在隨后的4個冷凍復(fù)蘇胚胎移植周期中均未能成功妊娠[1]。

病例4采用GnRH激動劑或拮抗劑方案促排卵2個周期，共獲得8枚OCCs，其中7個為空卵丘，1個為MⅡ卵(無ZP)，體積約為正常卵母細(xì)胞大小的1/2～1/3，行ICSI后未能正常受精，取消周期[2]。

病例5采用GnRH激動劑促排卵2個周期，第1個周期僅獲得2枚空卵丘，第2個周期獲得3枚卵母細(xì)胞均為ZP極薄且形態(tài)異常。經(jīng)體外培養(yǎng)后無極體排出，取消周期。

病例6采用GnRH激動劑方案促排卵2個周期，共獲得8枚OCCs。透明質(zhì)酸酶處理OCCs后其中4個為空卵丘，無卵母細(xì)胞或卵母細(xì)胞退化；MⅡ卵4枚(3個ZP極薄，1個無ZP)，行ICSI后2個卵母細(xì)胞正常受精，培養(yǎng)至第6天形成質(zhì)量較差的囊胚(6CC)予以冷凍保存，在隨后的冷凍復(fù)蘇周期移植后未能成功妊娠。全部病例的促排卵情況及助孕結(jié)局見表3。

表3 患者的促排卵情況及助孕結(jié)局

三、討論

ZP是包裹在卵母細(xì)胞以及植入前胚胎表面的多層糖蛋白。ZP在卵母細(xì)胞的發(fā)育，精卵識別、結(jié)合和穿透，促進(jìn)頂體反應(yīng)，阻止多精子受精，保護(hù)著床前胚胎等方面發(fā)揮著重要的作用[3]。人類的ZP蛋白包括ZP1、ZP2、ZP3和ZP4[4]，4種ZP蛋白間通過非共價鍵相互結(jié)合[5]，小鼠的ZP與人的高度同源且結(jié)構(gòu)相似，但僅由ZP1、ZP2和ZP3組成。ZP1蛋白貫穿連接ZP2和ZP3蛋白聚合物形成的花環(huán)體[6]，形成完整的ZP。ZP蛋白在卵細(xì)胞生長過程中由ZP基因編碼產(chǎn)生，ZP基因突變可能引起ZP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能改變，從而影響ZP蛋白間的相互作用及其纖維網(wǎng)絡(luò)的形成，最終可能會影響受精并引起女性不孕。

多項(xiàng)動物研究證實(shí)，ZP基因突變會引起卵母細(xì)胞形態(tài)異常，繼而影響生育能力。ZP1基因敲除小鼠表現(xiàn)為ZP結(jié)構(gòu)異常(ZP薄、松散)，其生育力僅為正常小鼠的一半[7]。缺乏ZP2的小鼠表現(xiàn)為ZTO且缺乏排卵前卵泡，當(dāng)小鼠繁殖期時，卵巢中竇卵泡數(shù)量顯著減少，排卵減少并且不能形成兩細(xì)胞期胚胎[8]，而且對缺乏ZP2的雌性小鼠的卵母細(xì)胞行IVF時，形成的囊胚不能正常發(fā)育。缺乏ZP3的小鼠雖然其它ZP蛋白均可正常表達(dá)，但不能形成ZP，幾乎不能排卵且缺乏生育能力[9]。與ZP2突變小鼠一樣，缺乏ZP3的小鼠的體外受精卵最多只能發(fā)育到囊胚期。ZP基因突變小鼠改變了ZP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響ZP的組成和組裝，進(jìn)而影響受精，導(dǎo)致生育障礙。

Huang等[10]首次發(fā)現(xiàn)了ZP1基因上的純合移碼突變c.1169_1176delTTT TCCCA(p.Ile390Thrfs*16)，該突變使ZP1基因的終止密碼子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)鏈后1/3整體丟失，全部卵母細(xì)胞表現(xiàn)為ZP缺失，患者失去生育力。Dai等[11]在5例因EFS導(dǎo)致的原發(fā)不孕的患者中發(fā)現(xiàn)了6個新的ZP1突變，且IVF周期中均未獲得卵母細(xì)胞或者僅見少量的胞漿碎片。Sun等[12]在2例因EFS導(dǎo)致的不孕姐妹中發(fā)現(xiàn)了ZP1基因的復(fù)合雜合突變(NM_207341.3：c.170_174del，p.G57Dfs*9 和c.1169_1176del，p.I390Tfs*16)，她們的卵母細(xì)胞均表現(xiàn)為退化，這與本研究中的病例1和病例2臨床表型相似，但本研究鑒定出的ZP1基因的復(fù)合雜合突變?yōu)閏.507delC，p.His170fs和c.239G>A，p.Cys80Tyr。已發(fā)現(xiàn)的這些ZP1基因的復(fù)合雜合突變可能導(dǎo)致ZP1蛋白缺失，通過阻斷了ZP1和ZP2、ZP3之間的相互作用，影響卵母細(xì)胞ZP的形成，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞變性或卵母細(xì)胞在卵泡穿刺過程中脆弱性增加，最終導(dǎo)致EFS和女性不孕[1，12]。

Chen等[13]報道了一個ZP3的雜合錯義突變(c.400G>A)，該突變阻礙了ZP2和ZP3之間的相互作用，破壞了ZP蛋白的組裝，導(dǎo)致卵母細(xì)胞變性和EFS。Cao等[14]也報道了相同的ZP3雜合突變(c.400G>A)，p.Ala134Thr突變體影響了ZP3和ZP2之間的相互作用導(dǎo)致ZP形成障礙，ZP3雜合突變患者在其IVF周期中表現(xiàn)為ZFO或完全無卵母細(xì)胞。Zhou等[15]報道了一個ZP3雜合突變(c.763C>G)，突變的ZP3蛋白可能與野生型的ZP3蛋白競爭與其他ZP蛋白的結(jié)合，影響ZP的形成從而導(dǎo)致ZFO或原發(fā)不孕。本研究發(fā)現(xiàn)了2例ZP3雜合突變(c.518C>G，p.Ser173Cys；c.400 G>T，p.Ala 134Ser)患者，她們的卵母細(xì)胞表現(xiàn)為相似的EFS或者無ZP。ZP3雜合突變降低了ZP3和ZP2之間的相互作用，影響ZP纖維網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致女性不孕[2]。

Liu等[16]首次描述了1例同時具有ZP2雜合錯義突變(c.2092C>T)和ZP3 雜合移碼突變(c.1045_1046insT)的患者資料，該患者第1個IVF周期，全部卵母細(xì)胞因無ZP而受精失??；第2個IVF周期卵母細(xì)胞ZP較薄，接受ICSI治療后成功活產(chǎn)。Dai等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在2例無血緣關(guān)系的女性中發(fā)現(xiàn)了2種ZP2的純合子突變(c.1695-2A>G，c.1691_1694dup p.C566Wfs*5)，所有攜帶突變的卵母細(xì)胞被一層薄的ZP所包圍，這2例患者在常規(guī)IVF中全部受精失敗，ICSI后分別受精率為100%和80%，1例患者于凍融周期移植2個囊胚后單胎妊娠并成功活產(chǎn)，另一例患者新鮮胚胎移植1個第5天囊胚，但植入失敗。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)病例3和病例6均為ZP2的復(fù)合雜合突變(c.860_861delTG，p.Val287fs和c.1924C>T，p.Arg642Ter；c.1695-2A>G和c.2407C>T，p.Arg642Ter)，病例3表現(xiàn)為大部分卵母細(xì)胞ZP較薄且卵周間隙大，少部分無ZP或卵母細(xì)胞退化，病例6則表現(xiàn)為大部分卵母細(xì)胞退化，少部分為ZP缺失或ZP極薄。經(jīng)多次凍融周期胚胎移植病例3和病例6均未成功妊娠。

本研究中的6例患者配偶精液檢查正常，首次體外受精均采用常規(guī)IVF，病例1、2、4、5、6第1個IVF周期均未獲得卵母細(xì)胞或者卵母細(xì)胞退化，只有病例3第1個IVF周期獲得5枚無ZP或者ZP極薄的卵母細(xì)胞，且均受精失敗，這與之前的報道一致[16-17]。突變的ZP2蛋白可能不會分泌到卵母細(xì)胞的表面，只能形成一個薄而有缺陷的ZP。ZP2介導(dǎo)了精子與ZP的結(jié)合，ZP缺陷的卵母細(xì)胞會導(dǎo)致與精子結(jié)合失敗，即精子無法成功穿透ZP，從而導(dǎo)致體外受精失敗和女性不孕[17-18]。根據(jù)之前的報道和我們的研究發(fā)現(xiàn)，病例3改做ICSI可以幫助患者改善受精結(jié)局，建議此類患者改變授精方式。對于具有空卵泡、ZP缺失或者ZP較薄等情況的患者，建議篩查ZP基因是否有突變?；谥皥蟮繸P基因突變引起的ZP變薄有成功活產(chǎn)案例，在與患者溝通并告知IVF的妊娠率較低的情況下可以嘗試ICSI。而如果患者促排卵幾次均無法獲得卵母細(xì)胞，且表現(xiàn)為EFS且ZP基因檢測異常，建議患者早日更改助孕策略，行供卵體外受精。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，ZP基因突變引起的EFS或ZP的異常會嚴(yán)重影響患者的助孕結(jié)局，建議用全外顯子組測序篩查ZP基因是否突變。本研究拓寬了女性不孕癥的遺傳原因，為女性不孕的基因診斷和進(jìn)一步的臨床診療提供了新的依據(jù)。