陳思杰，杜 娟，張 濤，顧沛雯

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium barbarum）為茄科枸杞屬落葉灌木，是我國(guó)傳統(tǒng)常用的中藥材之一。枸杞全身是寶，其果、葉、根、花均具有較高的藥用價(jià)值和保健效果。寧夏、甘肅、青海、新疆等地是枸杞的主要產(chǎn)區(qū)，其中以寧夏種植面積最大，占全國(guó)種植面積的1/3[1]。在所有枸杞產(chǎn)區(qū)中以寧夏枸杞藥用價(jià)值最高，為道地產(chǎn)區(qū)[2]。在中國(guó)等一些亞洲國(guó)家，枸杞的種植和使用已有2000多年歷史[3]。枸杞根腐病是寧夏枸杞常發(fā)病害，特別是隨著枸杞種植年限的延長(zhǎng)，發(fā)病率逐年加重。一般年份發(fā)病率為15%左右，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率最高達(dá)50%以上[4]，甚至造成死樹(shù)現(xiàn)象。給寧夏枸杞生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，已成為嚴(yán)重制約枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。

造成枸杞根腐病的主要病因是病原真菌侵染。據(jù)國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道認(rèn)為枸杞根腐病病原菌主要有尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysp orum）[5]、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）、串珠鐮刀菌（Fusariu mmonilifome）[6]，寄生疫霉（Phytophthora nicotianae var.parasitica）[7]等，不同枸杞產(chǎn)區(qū)病原菌種類(lèi)有較大差別，甘肅產(chǎn)區(qū)枸杞根腐病病原主要是腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），青海產(chǎn)區(qū)病原主要是尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），而新疆產(chǎn)區(qū)病原主要是寄生疫霉（P.nicotianae var.parasitica）和立枯絲核菌（R.solani）[5-7]。1994年，王國(guó)珍等[8]采用形態(tài)學(xué)的方法鑒定寧夏枸杞根腐病的病原為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄病鐮刀菌（F.solani）、同色鐮刀菌（F.concolor）和串珠鐮刀菌（F.moniliforme）。多年來(lái)，隨著寧夏枸杞品種更新和種植年限的延長(zhǎng)，寧夏枸杞根腐病病原種類(lèi)和數(shù)量已發(fā)生改變，但相關(guān)的研究報(bào)道較少。因此，本研究以從寧夏銀川地區(qū)采集枸杞根腐病病株為材料，利用組織分離法獲得純化菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行菌株鑒定，旨在明確寧夏枸杞根腐病主要病原的種類(lèi)和組成，為寧夏枸杞根腐病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 枸杞根腐病標(biāo)本采集及癥狀描述

2019年11月在寧夏銀川森淼枸杞園，對(duì)地上部有疑似枸杞根腐病癥狀的植株隨機(jī)挖取10株，進(jìn)行根腐病的初步診斷和癥狀描述。將根腐病患病植株根部帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行病原菌的分離鑒定，對(duì)典型癥狀拍照。

1.2 病原菌的分離

采用組織分離法[9]進(jìn)行病原菌的分離，先用流水沖洗患病部位，在病健交界處切取5 mm×5 mm的病組織，用70%的酒精消毒30 s后，5%的次氯酸鈉消毒3～5 min（依據(jù)組織大小延長(zhǎng)或縮短消毒時(shí)間），隨后無(wú)菌水沖洗3次，在無(wú)菌濾紙上吸干表面水分，轉(zhuǎn)移至PDA平板上。置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待病組織周?chē)L(zhǎng)出菌絲時(shí)，用接種環(huán)挑取尖端菌絲進(jìn)行純化，純化3次后的菌株接種在PDA斜面上，溫度為4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

參照張貞明等浸根接種法[10]的方法:將寧杞5號(hào)品種枸杞種子播種于直徑9 cm的塑料花盆中，置于溫度為22～30℃的室內(nèi)培育，至50 d時(shí)對(duì)枸杞苗根部稍有損傷，用孢子懸液浸根10 min后移至花盆繼續(xù)生長(zhǎng)，3次重復(fù)，用無(wú)菌水浸根做對(duì)照，接種菌株菌懸液質(zhì)量濃度為106個(gè)孢子·mL-1。每天觀察接種癥狀并對(duì)發(fā)病明顯植株重新分離并鑒定病原菌。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，溫度為25℃培養(yǎng)5 d，觀察病原菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征（菌落形狀、顏色、質(zhì)地等），產(chǎn)孢后挑取菌絲進(jìn)行鏡檢和拍照。根據(jù)菌株形態(tài)特征，參考《真菌鑒定手冊(cè)》[11]和《鐮刀菌屬》[12]進(jìn)行鑒定。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，帶菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)皿后，采用Biospin@真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原真菌基因組DNA，采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:DNA模板1μL，2×TaqMix酶12.5μL，引物各0.5μL，加ddH2O補(bǔ)足至25μL；擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序，所測(cè)序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)并下載同源性較高的序列，登錄號(hào)分別為MN559971.1、MT966030.1、MH172618.1、KJ866419.1、MT560375.1、MK729596.1、KT748520.1和MK174967.1。采用Mega X軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確病原菌分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞根腐病癥狀觀察

枸杞根腐病主要危害根部和莖基部，發(fā)病植株通常表現(xiàn)為葉片發(fā)黃、萎蔫，植物生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重時(shí)全株枯死，根莖部腐爛，剖開(kāi)病部可見(jiàn)維管束變?yōu)楹稚▓D1A～1B）。環(huán)境濕度大時(shí)，病部可見(jiàn)白色或粉紅色霉層（圖1C）。

圖1 枸杞根腐病癥

2.2 病原分離及致病性鑒定

對(duì)枸杞根腐病病部進(jìn)行病原菌分離、純化，共獲得38株純化菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，合并菌落、孢子等形態(tài)學(xué)相同的菌株，初步鑒定認(rèn)為所得菌株為4種類(lèi)型，其中LR-1分離數(shù)目最多（17株），分離頻率為44.74%；LR-5分離數(shù)目最少（3株），分離頻率為7.89%（表1）。對(duì)這4類(lèi)代表菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)接種4株菌株均可引起枸杞根莖部發(fā)病，與自然條件下枸杞根腐病癥狀相似，對(duì)發(fā)病部位再分離均可得到原接種所用菌株，確定以L(fǎng)R-1、LR-2、LR-4和LR-5為代表的4類(lèi)真菌菌株均為造成枸杞根腐病的致病菌株。

表1 從寧夏地區(qū)枸杞根腐病病部分離的真菌菌株

2.3 病原菌形態(tài)鑒定

LR-1在PDA上菌落呈白色規(guī)則圓形，氣生菌絲生長(zhǎng)速度比較快（圖2A）。小型分生孢子無(wú)色，卵圓形或橢圓形，大小為（5.1～13.2）μm×（2.1～3.7）μm；大分生孢子無(wú)色，鐮刀形，3～5個(gè)分隔，大小為（22.6～39.7）μm×（3.6～4.9）μm（圖2a）。初步鑒定為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）。

LR-2在PDA上菌落呈圓形或近圓形，菌絲體出為灰白色上生長(zhǎng)較快，后轉(zhuǎn)為灰褐色（圖2B）。菌絲呈銳角或直角，直徑5.1～7.1μm（圖2b）。初步鑒定為立枯絲核菌（R.solani）。

LR-4在PDA上菌落白色，氣生菌絲棉絮狀（圖2C），小型分生孢子長(zhǎng)橢圓形或棍棒型，大小為（6.5～17.2）μm×（2.6～3.4）μm，大型分生孢子中間粗，兩端細(xì)，基部有足細(xì)胞，3～5個(gè)分隔，大小為（16.5～36.2）μm×（3.6～4.4）μm（圖2c）。初步鑒定為木賊鐮刀菌（F.equiseti）。

LR-5在PDA上菌落呈近圓形，菌絲無(wú)色絨狀（圖2D）。大型分生孢子鐮刀形，2端較細(xì)，具2～8個(gè)隔膜，大小為（17.6～58.7）μm×（3.6～5.2）μm（圖2d）。初步鑒定為變紅鐮刀菌（F.incarnatum）。

圖2 枸杞根腐病病原真菌的形態(tài)特征

2.4 病原菌分子鑒定

利用引物ITS1/ITS4對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小為500～700 bp。將PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blasts分析，下載相似性高的序列，用Mega X軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。由圖3可知，菌株LR-1與GenBank登錄號(hào)為MN559971.1、MT966030.1的菌株聚在一起，同源性高達(dá)100%，為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）。菌株LR-2與GenBank登錄號(hào)為MH172618.1、KJ866419.1的菌株聚在一起，同源性達(dá)98%～100%，為立枯絲核菌（R.solani）。菌株LR-4與GenBank登錄號(hào)為MT560375.1、MK729596.1的菌株聚在一起，同源性達(dá)96%～100%，為木賊鐮刀菌（F.equiseti）。菌株LR-5與GenBank登錄號(hào)為KT748520.1、MK174967.1的菌株聚在一起，同源性高達(dá)100%，為變紅鐮刀菌（F.incarnatum）。

圖3 基于r DNA-ITS序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

枸杞根腐病素有“植物癌癥”之稱(chēng)，主要發(fā)生于枸杞的根和根莖部位，是枸杞栽培過(guò)程中的一類(lèi)重要的土傳病害，具有危害嚴(yán)重、防治難度大等特點(diǎn)[13]。本研究從寧夏銀川市采集的枸杞根腐病病樣中分離純化獲得4類(lèi)菌株，在形態(tài)學(xué)上以Booth等分類(lèi)特征為主[11，12，14]，結(jié)合rDNA-ITS序列分析為輔助手段，從寧夏枸杞產(chǎn)區(qū)根腐病患病植株分離到25株鐮刀菌屬菌株，其中尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）17株，木賊鐮刀菌（F.equiseti）5株，變紅鐮刀菌（F.incarnatum）3株，另有13株立枯絲核菌（R.solani），其分離頻率依次為44.74%、13.16%、7.89%和34.21%。通過(guò)致病測(cè)定，證明寧夏地區(qū)枸杞根腐病的病原為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、立枯絲核菌（R.solani）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）和變紅鐮刀菌（F.incarnatum），其可導(dǎo)致枸杞根莖部腐爛、維管束褐變，植株樹(shù)勢(shì)衰弱，甚至全株枯死。在分離到的多株病原菌中，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）占多數(shù)，為優(yōu)勢(shì)病原菌，這與劉振榮[4]、李捷等[15]對(duì)青海、甘肅靖遠(yuǎn)地區(qū)枸杞根腐病的研究結(jié)果一致，但未發(fā)現(xiàn)從新疆產(chǎn)區(qū)枸杞根腐病病部分離的主要病原寄生疫霉（P.nicotianae var.parasitica）[7]?？梢?jiàn)寧夏產(chǎn)區(qū)枸杞根腐病優(yōu)勢(shì)病原與其他產(chǎn)區(qū)存在較大差異，這可能與各產(chǎn)區(qū)地理位置、氣候、土壤條件等有關(guān)。

1994年，王國(guó)珍等[8]報(bào)道寧夏枸杞根腐病是由尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄類(lèi)鐮刀菌（F.solani）、同色鐮刀菌（F.concolor）和串珠鐮刀菌（F.moniliformesh eldon）復(fù)合侵染所致，且尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄類(lèi)鐮刀菌（F.solani）是主要致病菌。本研究未能從根腐病病部分離到茄類(lèi)鐮刀菌（F.solani）、同色鐮刀菌（F.concolor）和串珠鐮刀菌（F.moniliformesheldon），但分離獲得了木賊鐮刀菌（F.equiseti）和變紅鐮刀菌（F.incarnatum），這是寧夏枸杞根腐病新病原的首次報(bào)道。目前寧夏廣泛栽培的品種是寧杞5號(hào)和寧杞7號(hào)，推測(cè)可能是由于枸杞品種變化導(dǎo)致根腐病病原組成發(fā)生改變。國(guó)內(nèi)學(xué)者普遍認(rèn)為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）是枸杞根腐病的主要致病菌[6]，寄主范圍廣泛，可引起番茄[16]、草莓[17]、小麥[18]等植物根部腐爛、維管束變褐，甚至植物萎蔫死亡[19]。致病性尖孢鐮刀菌具有寄主特異性，根據(jù)寄主種類(lèi)、品種已劃分出150多個(gè)專(zhuān)化型[20]。但枸杞尖孢鐮刀菌寄主范圍尚未明確，后續(xù)將進(jìn)一步針對(duì)其寄主范圍、病原生物學(xué)、流行與防治展開(kāi)深入研究。