姚華娟，張雨婷，王紅梅，熊秀娟，宋恩霖*

(1.南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344000；2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

子宮頸癌是影響女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，且近年其發(fā)病有年青化趨勢(shì)，許多年青患者早期即出現(xiàn)不良的生物學(xué)行為，如局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良。故鑒定出與子宮頸癌不良生物學(xué)行為有關(guān)的分子靶標(biāo)，對(duì)子宮頸癌的治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。高危型人乳頭瘤病毒(HPV16/18)感染是引起子宮頸癌最主要的原因，目前有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在HPV16誘導(dǎo)下的角質(zhì)細(xì)胞中存在TEAD4的高水平表達(dá)[1]，說(shuō)明TEAD4很可能參與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，然而它對(duì)子宮頸鱗癌的具體調(diào)節(jié)功能尚不清楚。

TEAD4(transcriptional enhancer associate domain family member 4)屬于TEAD轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員之一[2]，TEAD4分子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能與YAP(Hippo信號(hào)通路中主要的共激活因子)相結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已發(fā)現(xiàn)，TEAD4與胃癌[3]、口腔鱗癌[4]等多種惡性腫瘤的不良生物學(xué)行為有關(guān)，但關(guān)于TEAD4與子宮頸癌的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)檢測(cè)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4蛋白的表達(dá)情況，分析TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌不良生物學(xué)行為之間的關(guān)系，在細(xì)胞學(xué)水平觀察高水平TEAD4的條件下，子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化，并進(jìn)一步觀察此條件下癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)變化情況，從而研究TEAD4與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌增殖和侵襲的關(guān)系及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的浸潤(rùn)性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌石蠟包埋標(biāo)本50例，患者平均年齡44歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療。另取20例正常宮頸上皮組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 免疫組化

采用MaxVision法，石蠟標(biāo)本3～5 μm厚切片，65 ℃烘箱烤片2 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來(lái)水沖洗，檸檬酸鈉抗原熱修復(fù)，3%H2O2處理，PBS漂洗。取目標(biāo)蛋白一抗(兔抗人TEAD4多克隆抗體，504151，成都正能生物技術(shù)有限公司；兔抗人MMP9多克隆抗體，27306-1-AP，美國(guó)Proteintech公司))工作液50 μL孵育，4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌后，每片滴加MaxVision二抗工作液(KIT-5010，福州邁新生物公司)50 μL，室溫下孵育30 min，充分洗滌后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。測(cè)量平均光密度(mean optic density,MOD)進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量結(jié)果判定。在光鏡下選取腫瘤組織中陽(yáng)性最強(qiáng)的3個(gè)高倍視野(×400)，數(shù)碼拍照，圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0準(zhǔn)確分割陽(yáng)性區(qū)域，測(cè)量MOD值。相同條件下，每張圖片測(cè)量3次，每張切片選取3張視野測(cè)量，以9次測(cè)量的MOD均值作為該視野中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞TEAD4基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa(TCHu113，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))用含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3×105/mL的細(xì)胞濃度接種2 mL細(xì)胞懸液于6孔板，24 h后更換為無(wú)血清無(wú)雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為3組：control組、vector組(空載質(zhì)粒)、pCMV3-TEAD4組，分別用無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM 500 μL稀釋6 μg的pCMV3-TEAD4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)、6 μg的pCMV3空載質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)和2只10 μL脂質(zhì)體Sinofection(STFO2，北京義翹神州生物公司)，室溫孵育5 min，各自將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育20～25 min，加入對(duì)應(yīng)孔板中。control組加入正常培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果及相關(guān)蛋白變化，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot

Ripa裂解液中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑，配成細(xì)胞裂解液。利用該細(xì)胞裂解液裂解目的細(xì)胞從而提取總蛋白，用以檢測(cè)TEAD4、p-ERK(兔抗人多克隆抗體，AF1015，購(gòu)自美國(guó)Affinity公司)、total-ERK(兔抗人多克隆抗體，16443-1-AP，美國(guó)Proteintech公司)和MMP9蛋白表達(dá)；蛋白濃度測(cè)定后，按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer和Ripa液配平，沸水加熱(5min)后冷卻離心上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4 ℃過(guò)夜；TBST洗滌后加入二抗(1:5 000)常溫?fù)u床孵育；洗滌膜后，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光，顯影。利用Image Pro Plus軟件測(cè)量目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將正常SiHa細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔100 μL含2 000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板，分為control組、vector組、pCMV3-TEAD4組，每組5個(gè)復(fù)孔，孔板中為無(wú)血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后分別對(duì)vector組和pCMV3-TEAD4組的癌細(xì)胞分別進(jìn)行空質(zhì)粒和pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，加入10%的CCK-8工作液(CCK-8試劑盒，CK04，北京沃比森科技公司)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖活力值。

1.6 Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將pCMV3空載質(zhì)粒(vector組)和pCMV3-TEAD4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pCMV3-TEAD4組)分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，將含有基膜提取物涂層并包被有聚碳酸酯膜的Coring Transwell小室置于24孔板，于小室的上室脂膜上鋪一層薄層Matrigel基質(zhì)膠(約100 μL)，待基質(zhì)膠自然干燥后再于上室接種100 μL上述細(xì)胞懸液(含5000個(gè)細(xì)胞)，通過(guò)上室的測(cè)孔于下室中加入含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL，并使得上室底部與下室培養(yǎng)基剛好接觸，37 ℃培養(yǎng)24 h后，各上室加入適量的蘇木精染色5 min，PBS洗滌，環(huán)形切割上室底部微孔膜，粘貼于載玻片，中性樹(shù)膠固封，顯微鏡下(×200)隨機(jī)觀察5個(gè)代表性視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)代表各組細(xì)胞的侵襲能力，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spear相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸鱗癌組織中TEAD4的表達(dá)

TEAD4在正常子宮頸上皮中的表達(dá)呈弱陽(yáng)性甚至陰性(圖1A)；而在子宮頸癌組織中的表達(dá)呈明顯強(qiáng)陽(yáng)性，其主要表達(dá)于子宮頸鱗癌細(xì)胞的胞質(zhì)和(或)胞核(圖1B)。光密度檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，TEAD4在宮頸鱗癌組織的平均表達(dá)水平(0.186±0.355)顯著高于其在正常子宮頸上皮中的表達(dá)水平(0.0494±0.0105，P<0.001，圖1C)。

圖1 (A)TEAD4在正常宮頸上皮組織中呈微弱表達(dá)(Maxvision染色,×400，箭頭：微弱表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞)、(B)TEAD4在宮頸鱗癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核(Maxvision染色,×400，箭頭：強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞)、(C)TEAD4在宮頸鱗癌(50例)中表達(dá)水平顯著高于正常宮頸上皮組織(20例)，*，P<0.001。

2.2 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)、脈管浸潤(rùn)(P<0.05)和宮旁浸潤(rùn)(P<0.05)有關(guān)，與腫瘤大小、分化程度以及患者的年齡無(wú)關(guān)(表1)。

表1 TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4的表達(dá)與MMP9表達(dá)的相關(guān)性

MMP9在正常宮頸上皮組織中呈弱表達(dá)(圖2A)，在子宮頸癌組織中呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)呈棕黃色顆粒(圖2B)，且MMP9的表達(dá)與TEAD4的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.394，P<0.01，圖2C)。

子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4表達(dá)水平

2.4 TEAD4過(guò)表達(dá)對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響

pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞中TEAD4的表達(dá)水平(0.84±0.037)顯著高于control組(0.43±0.061，P<0.01)和vector組(0.47±0.045，P<0.01)，而control組和vector組癌細(xì)胞中TEAD4的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，說(shuō)明基因轉(zhuǎn)染成功(圖3A-B)。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3C)，pCMV3-TEAD4組癌細(xì)胞增殖活力(1.18±0.067)分別顯著高于control組和vector組癌細(xì)胞(0.94±0.033，P<0.01；0.93±0.037，P<0.01)。

圖3 (A)宮頸鱗癌細(xì)胞TEAD4基因轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組中TEAD4蛋白的表達(dá)，con,空白對(duì)照組；vec，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組；pCMV3-TEAD4，TEAD4基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、(B)TEAD4在TEAD4基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(n=3)的表達(dá)水平分別顯著高于空白對(duì)照組(n=3,P<0.001)和陰性對(duì)照組(n=3,P<0.001)、(C)TEAD4基因轉(zhuǎn)染組宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖能力分別顯著高于空白對(duì)照組(n=5,P<0.001)和陰性對(duì)照組(n=5,P<0.001)。

2.5 TEAD4過(guò)表達(dá)對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4A)，pCMV3-TEAD4組癌細(xì)胞侵襲能力(81.3±7.23)分別顯著高于control組和vector組癌細(xì)胞(55.3±8.50，P<0.05；59.0±8.54，P<0.05)(圖4B)。

圖4 (A)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)比較TEAD4基因轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組的宮頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力；con，空白對(duì)照組，vec，陰性對(duì)照組，pCMV3-TEAD4,TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(n=3，蘇木素染色，×200)、(B)TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(n=3)癌細(xì)胞侵襲能力分別顯著高于空白對(duì)照組(n=3，P<0.05)和陰性對(duì)照組(n=3，P<0.05)。

2.6 TEAD4高表達(dá)對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞中ERK磷酸化與MMP9蛋白表達(dá)的影響

pCMV3-TEAD4組癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)水平為(0.93±0.046)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(0.51±0.040，P<0.05)組(圖5)，而且pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平(0.57±0.056)顯著高于control組(0.34±0.021，P<0.05)，提示TEAD4高表達(dá)可上調(diào)子宮頸鱗癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)水平(圖5)。

2.7 ERK活化對(duì)TEAD4上調(diào)MMP9表達(dá)的影響

利用ERK抑制劑U0126預(yù)處理癌細(xì)胞后再進(jìn)行pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，此聯(lián)合處理組的癌細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平(0.277±0.060)顯著低于上述pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，且此時(shí)聯(lián)合處理組癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)水平(0.46±0.046)也顯著低于pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.93±0.046，P<0.01)，而聯(lián)合處理組和pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間的TEAD4的表達(dá)水平無(wú)顯著差異性(P>0.05)(圖5)。圖5結(jié)果顯示，高表達(dá)TEAD4能增強(qiáng)或提高癌細(xì)胞中p-ERK水平和MMP9的表達(dá)，且p-ERK能提高M(jìn)MP9的表達(dá)，表明TEAD4能提高癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)是通過(guò)增加p-ERK水平實(shí)現(xiàn)的。

圖5 (A)MMP9和P-ERK在正常對(duì)照組癌細(xì)胞、TEAD4基因轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞和ERK抑制劑與TEAD4基因轉(zhuǎn)染的聯(lián)合處理組癌細(xì)胞中的表達(dá)，con，正常對(duì)照組(n=3)，TEAD4+，TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(n=3)，U0126+TEAD4+,ERK抑制劑U0126與TEAD4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合處理組(n=3)、(B)MMP9和P-ERK在TEAD4基因轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞中的表達(dá)水平分別顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.05)，而MMP9和P-ERK在ERK抑制劑與TEAD4基因轉(zhuǎn)染的聯(lián)合處理組癌細(xì)胞中的表達(dá)水平分別顯著低于TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(P<0.01，P<0.01)。

3 討論

作為TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白之一，TEAD4分子結(jié)構(gòu)N-末端含有能與基因啟動(dòng)子區(qū)MACT模序結(jié)合的TEA(transcription enchance activation)結(jié)構(gòu)域[5]，C-末端具有與轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[2]。TEAD4的分子結(jié)構(gòu)特征決定了它能與Hippo信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄共激活子YAP(Yes-associated protein)相結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，從而介導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或偶聯(lián)其他信號(hào)通路的激活。Hippo在調(diào)控器官大小與組織穩(wěn)態(tài)方面起著非常重要的作用[6]，Hippo信號(hào)通路失調(diào)會(huì)導(dǎo)致器官過(guò)度生長(zhǎng)乃至腫瘤的發(fā)生，因此TEAD4對(duì)YAP轉(zhuǎn)錄功能的活化作用，決定了TEAD4具有類似原癌基因的功能。TEAD4-YAP作用可通過(guò)介導(dǎo)多種下游靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤的代謝[7]、生長(zhǎng)[8]、浸潤(rùn)[9]和轉(zhuǎn)移[10]等生物學(xué)行為，從而影響惡性腫瘤的進(jìn)展。有研究報(bào)道，TEAD4的高表達(dá)與頭頸鱗癌[11]、膀胱癌[12]和膠質(zhì)瘤[13]等多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。至于TEAD4與宮頸癌之間的關(guān)系，目前鮮有報(bào)道，然而卻有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，HPV16可誘導(dǎo)角質(zhì)上皮細(xì)胞中TEAD4的高表達(dá)[1]。HPV16感染是宮頸鱗狀細(xì)胞癌的主要病因之一，HPV16能誘導(dǎo)TEAD4表達(dá)上調(diào)，這一實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示TEAD4很可能參與調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。鑒于前人已研究證實(shí)TEAD4對(duì)多種惡性腫瘤進(jìn)展具有調(diào)節(jié)作用，出于興趣，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)兩個(gè)水平，研究TEAD4對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)能力的影響，并初步探討其可能的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)結(jié)果顯示，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4的表達(dá)水平顯著高于正常子宮頸上皮組織，提示子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中存在TEAD4的高表達(dá)。進(jìn)一步的臨床病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)和宮旁浸潤(rùn)有關(guān)，提示TEAD4可能調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力等不良生物學(xué)行為，從而促進(jìn)子宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。Zhang[11]等研究證實(shí)，TEAD4高表達(dá)于頭頸鱗癌組織，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良生物學(xué)行為有關(guān)，我們的組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zhang等的研究報(bào)道基本相符。為初步揭示TEAD4促進(jìn)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲進(jìn)展的可能機(jī)制，我們檢測(cè)了與癌生長(zhǎng)侵襲有關(guān)的最常見(jiàn)指標(biāo)MMP9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP9的表達(dá)與TEAD4的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果暗示，TEAD4可能是通過(guò)介導(dǎo)MMP9的表達(dá)上調(diào)從而調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的手段改變子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中TEAD4的表達(dá)水平，從而觀察高水平的TEAD4對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞增殖活力顯著高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組，說(shuō)明TEAD4能提高子宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照的癌細(xì)胞相比，TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞表現(xiàn)出顯著升高的侵襲能力，說(shuō)明TEAD4能提高子宮頸鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。為進(jìn)一步探明TEAD4提高子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力是否與MMP9有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)在上述條件下子宮頸鱗癌細(xì)胞中MMP9的蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞中，MMP9的表達(dá)水平也高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組。該結(jié)果說(shuō)明，TEAD4能介導(dǎo)子宮頸鱗癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)上調(diào)。MMP9是一個(gè)經(jīng)典的調(diào)節(jié)因子，在不同組織起源的癌細(xì)胞中能通過(guò)不同的信號(hào)機(jī)制提高癌細(xì)胞生長(zhǎng)和浸潤(rùn)能力[14-16]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示，TEAD4可能通過(guò)上調(diào)MMP9的表達(dá)而促進(jìn)子宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。誠(chéng)然，TEAD4能介導(dǎo)多種下游效應(yīng)分子的表達(dá)，例如有研究報(bào)道，TEAD4-YAP能通過(guò)介導(dǎo)CTGF(結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和浸潤(rùn)能力[17]，且可通過(guò)介導(dǎo)Jagged1的表達(dá)上調(diào)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力[18]。除了MMP9之外，TEAD4是否還能通過(guò)介導(dǎo)其他的下游靶基因轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)子宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)能力，尚須進(jìn)一步研究。

為深入研究TEAD4調(diào)節(jié)子宮頸鱗癌增殖和浸潤(rùn)能力的分子機(jī)制，本課題檢測(cè)了在不同的TEAD4表達(dá)水平條件下癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)分子的活化水平情況。在TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞中，ERK的活化形式P-ERK的水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組，說(shuō)明TEAD4能活化子宮頸鱗癌細(xì)胞中ERK信號(hào)。為進(jìn)一步明確TEAD4介導(dǎo)MMP9的表達(dá)上調(diào)是否與ERK信號(hào)的活化有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)利用ERK活化抑制劑U0126預(yù)處理子宮頸鱗癌細(xì)胞，然后再進(jìn)行TEAD4基因轉(zhuǎn)染，結(jié)果驚奇的發(fā)現(xiàn)，與正常轉(zhuǎn)染組的癌細(xì)胞相比，在ERK活化受抑制的條件下，癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)水平顯著低于正常轉(zhuǎn)染組，這一結(jié)果說(shuō)明TEAD4是通過(guò)激活子宮頸鱗癌細(xì)胞ERK信號(hào)這一途徑來(lái)上調(diào)下游靶基因MMP9的表達(dá)。Chang等研究證實(shí)[19]，TEAD4能通過(guò)活化ERK信號(hào)通路而促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Chang的研究結(jié)果相符。作為經(jīng)典的Hippo信號(hào)共激活子，TEAD4通常與YAP結(jié)合形成復(fù)合物介導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或者偶聯(lián)其他信號(hào)通路的活化，但最新有學(xué)者通過(guò)與YAP結(jié)合缺陷的突變體TEAD4Y429進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TEAD4能通過(guò)不依賴與YAP結(jié)合的方式調(diào)控結(jié)腸癌中Vimentin的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌EMT的發(fā)生[20]，這可能與TEAD4分子結(jié)構(gòu)中的DNA結(jié)合域的功能有關(guān)。可見(jiàn)，TEAD4可通過(guò)YAP依賴和YAP非依賴的方式介導(dǎo)下游靶分子的活化或轉(zhuǎn)錄，那么在子宮頸鱗癌細(xì)胞中，TEAD4介導(dǎo)ERK信號(hào)的活化是否具有YAP依賴性，尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，本課題組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TEAD4表達(dá)于子宮頸鱗癌細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核，TEAD4促進(jìn)子宮頸鱗癌生長(zhǎng)浸潤(rùn)能力是否與它在癌細(xì)胞中的表達(dá)定位有關(guān)，也值得我們深入研究。

綜上所述，本研究證實(shí)子宮頸鱗癌中存在TEAD4的高表達(dá)，TEAD4能提高子宮頸鱗癌的生長(zhǎng)浸潤(rùn)能力，其分子機(jī)制與TEAD4活化ERK信號(hào)從而上調(diào)癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)有關(guān)。