周春花，鐘偉翔，陳金萍，歐陽(yáng)珊,b，吳小平,b*

(南昌大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.鄱陽(yáng)湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031)

人為活動(dòng)對(duì)于全球生物多樣性具有廣泛影響，并可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)和功能產(chǎn)生負(fù)面影響[1]。淡水生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性喪失的速度越來(lái)越快，超過(guò)了陸地或海洋環(huán)境[2]。這使得人們迫切需要開(kāi)發(fā)監(jiān)測(cè)工具，以快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)淡水生態(tài)系統(tǒng)中的生物群落組成?，F(xiàn)有的生物多樣性調(diào)查技術(shù)(網(wǎng)捕)因其方法上的局限性(例如，觀察者偏見(jiàn)、對(duì)物種的二次傷害)而受到批評(píng)[3]。一種可能克服上述一些局限性的方法是使用在環(huán)境樣本(例如水、土壤或沉積物)中發(fā)現(xiàn)的DNA來(lái)推斷生態(tài)系統(tǒng)中的生物體是否存在[4]。這種被稱為環(huán)境DNA(environmental DNA,eDNA)的遺傳物質(zhì)是組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞碎片和在生物正常生活和死亡過(guò)程中丟失到環(huán)境中的胞外DNA的多聚分散混合物[5]。環(huán)境DNA調(diào)查已用于通過(guò)qPCR分析進(jìn)行目標(biāo)檢測(cè)(即單一物種)，以及用于使用宏條形碼技術(shù)的群落(即多物種)研究[6-7]。近年來(lái)，環(huán)境DNA宏條形碼已被廣泛運(yùn)用于淡水生態(tài)系統(tǒng)的漁業(yè)管理與多樣性監(jiān)測(cè)中[8]。在美國(guó)上百個(gè)池塘、小溪、河流的生物多樣性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)多種兩棲動(dòng)物、魚類、哺乳動(dòng)物、昆蟲和甲殼類動(dòng)物[9]。通過(guò)使用多對(duì)魚類宏條形碼引物從水庫(kù)中檢測(cè)出了傳統(tǒng)方法監(jiān)測(cè)到的所有魚類物種[10]。Zhang等對(duì)基于環(huán)境DNA技術(shù)系統(tǒng)研究了空間采樣設(shè)計(jì)對(duì)3個(gè)不同大小的湖泊的魚類群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果支持岸邊采樣同樣有效[11]。這些調(diào)查非常敏感，一旦方法得到優(yōu)化，就可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[12]。然而，其有效性和可復(fù)制性依賴于恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)取樣、測(cè)序文庫(kù)制備和生物信息學(xué)分析過(guò)程中方法選擇的影響的理解[13]。雖然一致認(rèn)為環(huán)境DNA調(diào)查信息豐富，可以補(bǔ)充其他生物多樣性監(jiān)測(cè)方法[14]，但eDNA對(duì)不同環(huán)境樣本類型如何影響物種可檢測(cè)性的研究仍然很少[15]。

鄱陽(yáng)湖為中國(guó)最大的淡水湖泊，是生物多樣性的熱點(diǎn)區(qū)[16]。近年來(lái)，圍湖造田、湖沙挖掘、攔河筑壩、圍堤養(yǎng)殖、過(guò)度捕撈等人類活動(dòng)，嚴(yán)重影響鄱陽(yáng)湖的生物多樣性(特別是魚類物種)。鄱陽(yáng)湖生物多樣性與生態(tài)平衡問(wèn)題受到國(guó)家和政府的密切關(guān)注，制定了相關(guān)的禁漁措施[17]。鄱陽(yáng)湖生物多樣性保護(hù)與生態(tài)恢復(fù)迫切需要建立快速有效和環(huán)境友好的監(jiān)測(cè)機(jī)制，為漁業(yè)管理以及生態(tài)保護(hù)政策的制定與實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)。本研究運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)探討鄱陽(yáng)湖不同的環(huán)境樣本類型如何影響物種的可檢測(cè)性，為進(jìn)行環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)時(shí)取樣策略的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

本研究于2020年1月在鄱陽(yáng)湖水域進(jìn)行采樣，共設(shè)置10個(gè)采樣點(diǎn)。在每個(gè)采樣點(diǎn)用采水器采集1L上層水于無(wú)菌的可密封廣口瓶中，且每個(gè)樣點(diǎn)做3次重復(fù)采樣。用采泥器在采水樣的地點(diǎn)同時(shí)采集沉積物于30 mL無(wú)菌密封廣口瓶中，每個(gè)樣點(diǎn)做3次重復(fù)采樣。所有的樣品冰上保存。環(huán)境水樣于24 h之內(nèi)用0.45 μm的混合纖維素酯膜濾膜及Rocker 300無(wú)油真空泵抽濾。每次過(guò)濾前后，均對(duì)實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行消毒清洗，避免交叉污染。每次過(guò)濾用蒸餾水做陰性對(duì)照，以評(píng)估外源DNA污染是否存在。在每份水樣過(guò)濾后，濾膜立即冷凍保存。

1.2 環(huán)境DNA提取及擴(kuò)增

使用試劑盒DNeasy? Blood &Tissue Kit(Qiagen?)提取濾膜中的水樣環(huán)境DNA(步驟做了適當(dāng)優(yōu)化)。使用DNeasy? PowerSoil Kit(Qiagen?)提取沉積物DNA。每個(gè)樣點(diǎn)做的3次重復(fù)，合并DNA。用Qubit(Thermo Fisher Scientific)測(cè)試DNA濃度。利用線粒體細(xì)胞色素b簡(jiǎn)并引物L(fēng)14912-CYB：5’-TTCCTAGCCATACAYTAYAC-3’(Y=C或T)，下游引物H15149-CYB：5’-GGTGGCKCCTCAGAAGACATTTGKCCYCA-3’(K=G或T，Y=C或T)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約285 bp[18]。PCR反應(yīng)體系為25 μL：5×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol)2 μL,加標(biāo)記的上、下游引物(10 uMol)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 13.75 μL，Q5 DNA Polymerase(2 U/μL)0.25 μL。PCR程序：98℃ 預(yù)變性2 min；98℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min；10℃保存。每次PCR均設(shè)置陰性對(duì)照。每個(gè)樣本做3次重復(fù)PCR，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序、OUT劃分及注釋

對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物用Qubit?3.0(Life Invitrogen)進(jìn)行定量。測(cè)序使用Illumina MiSeq(2×300 bp)和MiSeq Reagent Kit v3按照說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。測(cè)序策略為Mova-Seq-PE250。測(cè)序數(shù)據(jù)量為每個(gè)樣本的有效序列約6萬(wàn)條。使用QIIME軟件將低質(zhì)量的序列按照以下條件去除：(1)長(zhǎng)度小于150 bp的序列，(2)平均Phred值<20的序列，(3)含有模糊堿基N的序列，(4)含有>8 bp的單核苷酸重復(fù)序列等。將獲得的高質(zhì)量序列一致性大于97%的聚類為一個(gè)OTUs(operational taxonomic units,OTUs)，從每個(gè)OTU選擇一個(gè)代表性的，再用BLAST與GenBank進(jìn)行比對(duì)，并分配給總分最高的分類單元。從GenBank中下載鄱陽(yáng)湖流域的118種魚類線粒體基因組序列構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。將OTU代表序列比對(duì)到本地庫(kù)，設(shè)置比對(duì)參數(shù)E-value<10-12，identity≥97%，并綜合公司比對(duì)的結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 物種組成分析

本研究通過(guò)對(duì)20個(gè)樣本(空白對(duì)照在PCR擴(kuò)增中并未產(chǎn)生目的條帶，未進(jìn)行高通量測(cè)序)采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，經(jīng)質(zhì)控處理后，共得到102萬(wàn)條有效序列，平均長(zhǎng)度270bp。按序列相似性≥97%聚類，得到892個(gè)OTU。本研究共注釋到魚類7目11科23種(表1)，其中沉積物樣本注釋到6目10科18種，水樣中注釋到5目7科13種。沉積物中注釋到的魚類物種數(shù)更多。水樣和沉積物環(huán)境DNA共同注釋到8種魚類(32%)，僅通過(guò)沉積物環(huán)境DNA注釋到10種魚類(43.48%)，僅通過(guò)水樣環(huán)境DNA注釋到5種魚類(27.14%)。本研究注釋到的魚以小型、湖泊定居型、雜食性魚類為主。沉積物樣本中注釋到的魚類有6種上層魚、1種下層魚和11種底層魚，水體樣本中注釋到的魚類有6種上層魚、3種下層魚和4種底層魚。

表1 環(huán)境DNA水樣及沉積物監(jiān)測(cè)的鄱陽(yáng)湖魚類物種

2.2 Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)，沉積物的平均值為4.6(變幅2～9)，水體的平均值為3.6(變幅為1～7)。Shannon-Weiner指數(shù)，沉積物的平均值為0.80(變幅為0.03～1.59)，水樣的平均值為0.50(變幅為0～1.31)。Simpson指數(shù)，沉積物的平均值0.29(變幅為0.01～0.59)，水樣的平均值為0.22(變幅為0～0.47)。Pielou指數(shù)，沉積物的平均值為0.59(變幅為0.04～1.07)，水樣的平均值為0.40(變幅為0～1.32)。由圖1可知，沉積物的4種多樣性指數(shù)均高于水樣的，但兩者之間無(wú)顯著性差異。

圖1 沉積物和水樣樣本注釋到魚類的多樣性指數(shù)

2.3 Beta多樣性分析

環(huán)境DNA方法沉積物與水樣在魚類群落相似性的NMDS排序在結(jié)構(gòu)相似(stress=0.18)，由分析圖表明(圖2)，沉積物和水樣的樣本點(diǎn)距離較近，有重疊區(qū)域，通過(guò)Adonis分析表明，沉積物和水樣的環(huán)境DNA注釋到的魚類的群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著性差異(R2=0.662，P=0.418)。

圖2 沉積物和水樣中鑒定的魚類群落NMDS排序

3 討論

本研究基于沉積物和水體環(huán)境DNA共注釋到鄱陽(yáng)湖的23種魚中，鯉科魚類物種數(shù)最多(表1)，占比最高(43.5%)，這與傳統(tǒng)方法調(diào)查得出的結(jié)果一致[20]。本研究注釋到的魚按生態(tài)類型分，以湖泊定居型，這和楊少榮等得出的結(jié)果相類[27]。本研究基于環(huán)境DNA宏條形碼得出鄱陽(yáng)湖以小型魚類為主，這和傳統(tǒng)方法研究結(jié)果相同[28]。本研究只檢測(cè)到了四大家魚中的鳙，而沒(méi)有檢測(cè)到青魚、草魚、鳊和鰱，原因可能與采樣的水層有關(guān)，鳙是中上層魚，青魚、草魚和鳊是中下層魚，而本研究只采了上層水；也可能與引物的通用性和高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)量有關(guān)。本研究沒(méi)有對(duì)優(yōu)勢(shì)魚類物種即序列數(shù)多的魚類進(jìn)行討論，是因?yàn)镻CR擴(kuò)增過(guò)程中引物會(huì)有偏好性。很多研究表明PCR的偏好性是造成環(huán)境DNA對(duì)某些低豐度物種檢測(cè)不到和物種生物量估測(cè)錯(cuò)誤的最主要因素[29]?，F(xiàn)有環(huán)境DNA分析大多依賴PCR擴(kuò)增，因此控制和減輕PCR的偏好性是環(huán)境DNA對(duì)生物多樣性監(jiān)測(cè)的主要挑戰(zhàn)之一。此外，使用環(huán)境DNA濃度估計(jì)物種豐度并沒(méi)有那么簡(jiǎn)單[30]。因?yàn)榄h(huán)境DNA在溪流和河流中隨水流順流而下的過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生遷移、稀釋、滯留和再懸浮，這使得環(huán)境DNA濃度數(shù)據(jù)的解釋更加復(fù)雜[31]。一些研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA和生物量之間存在積極但微弱的關(guān)系[32]，而其他研究發(fā)現(xiàn)根本沒(méi)有關(guān)系[33]。

4 結(jié)論

本研究首次使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)評(píng)估了鄱陽(yáng)湖不同的環(huán)境樣本類型如何影響魚類物種的可檢測(cè)性。沉積物樣本中檢測(cè)到的魚類的多樣性高于水體中的，在進(jìn)行環(huán)境DNA調(diào)查時(shí)需要仔細(xì)考慮環(huán)境樣本類型。建議在使用環(huán)境DNA進(jìn)行魚類資源研究時(shí)，取樣策略采取沉積物樣本和水體樣本相結(jié)合將會(huì)更有意義。中國(guó)政府曾經(jīng)只在長(zhǎng)江某些地區(qū)的春季魚類產(chǎn)卵季節(jié)禁止捕魚，但現(xiàn)在已經(jīng)在長(zhǎng)江的關(guān)鍵地區(qū)實(shí)施了為期10年的全面禁漁。因此，環(huán)境DNA宏條形碼以其采樣非侵入性且分辨率高的優(yōu)勢(shì)逐漸地成為水生生物多樣性調(diào)查的重要補(bǔ)充工具。