瑪依努爾·尼牙孜,伊力努爾·哈力甫,王 琳,韓莉莉,魯 靜,阿依米熱·艾山江,朱開春

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,烏魯木齊 830001)

宮頸癌是全球女性中第二大常見癌癥，是發(fā)展中國家女性癌癥死亡的主要原因[1]。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[2]，但病毒介導(dǎo)的癌變機(jī)制尚未完全了解[3]。microRNA(miRNA)作為細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡和宿主-病毒相互作用等各種過程的重要調(diào)節(jié)因子[4-5]，其發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)機(jī)制與許多癌癥有關(guān)，包括與HPV感染相關(guān)的癌癥。研究表明，HPV E6和E7癌基因表達(dá)參與調(diào)控并破壞細(xì)胞miRNA表達(dá)，許多細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子包括NF-κB、pRb和p53等已被確定可調(diào)節(jié)miRNA的轉(zhuǎn)錄[6]。miRNA(miR)-150位于染色體19q13，在大量癌癥，如白血病和結(jié)直腸癌中作為原發(fā)腫瘤miRNA發(fā)揮作用[7]，可通過促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和侵襲作為癌基因，或通過抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移作為腫瘤抑制因子[8]。研究證明，miR-150異常表達(dá)和失調(diào)與各種類型的血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤密切相關(guān)[9-10]。Abdelhalim等[9]通過對急性髓系白血病患者進(jìn)行miR-150表達(dá)譜分析，表明miR-150在抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起到腫瘤抑制作用，并且減緩白血病病情發(fā)展。Tian等[11]證明p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(PUMA)可作為miR-150的潛在靶基因，表現(xiàn)為miR-150抑制PUMA從而誘導(dǎo)炎癥和β細(xì)胞凋亡，而NF-κB通過與miR-150啟動子結(jié)合激活miR-150表達(dá)，從而防止炎癥和β細(xì)胞凋亡。Fa等[12]通過對甲狀腺乳頭狀癌分析，證明黏蛋白4(MUC4)是miR-150的直接靶標(biāo)，miRNA介導(dǎo)的MUC4下調(diào)與伴隨的人表皮生長因子受體2及其磷酸化形成的減少有關(guān)，從而抑制下游信號的激活。研究表明，miRNA可作為腫瘤抑制基因或致癌基因，并且相同的miRNA可在不同腫瘤類型中發(fā)揮相反的作用[13]。因此，miR-150表達(dá)譜及其在宮頸癌中的直接靶點(diǎn)仍難以捉摸。本研究旨在探討microRNA-150(miR-150)與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 資料來源 收集2017年1月至2018年12月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科收治的23例宮頸癌患者的癌組織及癌旁組織樣本?；颊逪PV16/HPV18陽性，平均年齡(52.00±11.91)歲，其中維吾爾族17例，漢族6例。收集正常宮頸上皮脫落細(xì)胞(cervical exfoliated cells，CEC)樣本10例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查和批準(zhǔn)。宮頸癌細(xì)胞系SiHa(HPV16)及HeLa(HPV18)購自ATCC，并進(jìn)行STR驗(yàn)證。細(xì)胞培養(yǎng)使用10%胎牛血清、1%雙抗、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-150 mimics(5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3')及miR mimics陰性對照(mimics-NC)(5'-CCGAAACCUCGGUUGAUUGCGG-3')購自上海生工。根據(jù)說明書，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)進(jìn)行SiHa細(xì)胞及HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染。置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h用于進(jìn)一步分析。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力 將SiHa及HeLa細(xì)胞按5×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24、48h和72h。每孔加10μL MTT(5mg/mL)，37℃孵育4h。取出棄上清，加二甲基亞砜(150μL/孔)，37℃下溶解甲臜晶體30min。使用Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo fisher,USA)于450nm波長處測量吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將SiHa及HeLa細(xì)胞按5×105細(xì)胞/mL接種至Transwell培養(yǎng)板上室，下室中加含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。孵育24h，用棉簽去除上室中未遷移細(xì)胞，濾膜下側(cè)的遷移細(xì)胞室溫下用100%甲醇固定15min，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下對遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 RT-qPCR TRIzol試劑(ThermoFisher,Invitrogen,15596026)提取組織及細(xì)胞總RNA。按PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(Takara,RR037A)步驟，將提取的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara,638315)試劑盒檢測miR-150表達(dá)，U6為內(nèi)參基因。SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara Biotechnology,Co.,Ltd.)檢測MUC4 mRNA表達(dá)，GAPDH(NM_001256799.3)為內(nèi)參基因。qPCR引物購自上海生工(表1)。按95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)設(shè)置熒光定量PCR儀(AGS，AFD4800)，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

表1 引物信息

1.2.5 Western blot 用RIPA裂解緩沖液(Biosharp,BL504A)提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(biosharp,BL521A)定量總蛋白(40μg/泳道)，配制10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠，4%SDS-PAGE濃縮膠，上樣進(jìn)行SDS-PAGE。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(PVDF)，置于5%BSA(biofroxx,4240GR025)室溫封閉2h，與一抗MUC4(1∶1000,ab60720,Abcam)、GAPDH(1∶1000.ab8245,Abcam)4℃孵育過夜。TBST洗滌膜3次，每次5min；將PVDF膜放入二抗稀釋液(1∶10,000,ab191866,ab218695,Abcam)，37℃水浴搖床避光孵育1h，TBST洗滌膜3次，每次5min。將ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑(Solarbio，PE0010)A液和B液1∶1混合均勻，均勻涂在目的條帶附近，在暗室中壓片曝光顯影。Image J軟件(V1.52s，Bharti Airtel Ltd)對膠片進(jìn)行灰度掃描。

1.2.6 使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色的落射熒光顯微鏡檢測細(xì)胞自噬 miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后48h收獲SiHa和HeLa細(xì)胞，并用5μg/mL AO及PI染料染色。使用ZISS ScopeA1熒光倒置顯微鏡在20×、40×物鏡下通過FITC/TRITC通道觀察并分析樣品。

1.2.7 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 使miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫Targetscan(www.targetscan.org/vert_71)和miRbase(https://www.mirbase.org/)預(yù)測miR-150的假定靶基因。為了研究miR-150對MUC4表達(dá)的直接影響，使用含MUC4 3'-UTR區(qū)域的pEZX-MT01靶標(biāo)報(bào)告質(zhì)粒(GeneCopoeia,Inc.,Rockville,MD,USA)。使用QuickchangeII定點(diǎn)突變試劑盒(200521,Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)在野生型MUC4 3'-UTR (WT)中miR-150的預(yù)測靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，生成MUC4 3'-UTR突變(MUT-MUC4 3' UTR)報(bào)告基因質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)在96孔板中將報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-150 mimics或mimics-NC共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48h使用酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌中miR-150及MUC4表達(dá) RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與匹配的癌旁組織相比，宮頸癌組織中miR-150相對表達(dá)量顯著降低、MUC4相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01)(圖1A、B)；與正常宮頸上皮細(xì)胞系比較，SiHa、HeLa細(xì)胞中miR-150相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，MUC4相對表達(dá)量顯著增高(P<0.01)(圖1C、D)。Western blot檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組織中MUC4蛋白表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.01)(圖1E、F)。

2.2 miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲 miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后，SiHa細(xì)胞及HeLa細(xì)胞中miR-150表達(dá)量均顯著高于mimics-NC組(P<0.05)；miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后48、72h，SiHa、HeLa細(xì)胞增殖顯著抑制(P<0.05)，轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞侵襲顯著抑制(P<0.05),見圖2。

2.3 miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后增加宮頸癌細(xì)胞的自噬 轉(zhuǎn)染后48h，收集宮頸癌細(xì)胞，AO及PI染色后熒光倒置顯微鏡觀察自噬情況并拍照。結(jié)果顯示，mimics-NC組細(xì)胞中主要為綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成分中的紅色熒光極少，提示基本上無自噬發(fā)生；miR-150 mimics組細(xì)胞顯示大量紅色熒光，表明形成了大量酸性自噬溶酶體液泡并誘導(dǎo)了早期細(xì)胞凋亡。同時(shí)，SiHa細(xì)胞及HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的早期凋亡細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核破碎，核膜受損。見圖3。

圖1 宮頸癌組織及細(xì)胞中miR-150及MUC4的表達(dá)

圖2 miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后SiHa及HeLa細(xì)胞的增殖與侵襲

圖3 miR-150 mimics轉(zhuǎn)染后SiHa及HeLa細(xì)胞吖啶橙(AO)染色觀察細(xì)胞自噬

2.4 MUC4是miR-150的直接靶標(biāo) Targetscan和miRbase數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)果示，MUC4為miR-150的潛在靶點(diǎn)，在MUC4 3'-UTR中鑒定了miR-150的假定結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證miR-150是否介導(dǎo)MUC4表達(dá)。MUC4 mRNA的3'-UTR，包括推定的miR-150結(jié)合序列(WT 3'-UTR)或突變序列(MUT 3'-UTR)，被亞克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中。與MUC4 WT共轉(zhuǎn)染的SiHa及HeLa細(xì)胞中，過表達(dá)miR-150導(dǎo)致熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而在與MUC4 MUT共轉(zhuǎn)染的SiHa及HeLa細(xì)胞中未降低。表明MUC4是miR-150的直接靶標(biāo)。miR-150 mimics組SiHa及HeLa細(xì)胞中MUC4 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于mimics-NC組(P<0.01)。見圖4。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測MUC4是miR-150的直接靶標(biāo)

3 討 論

大量研究證明，miRNAs通過與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要作用[14-16]。失調(diào)的miRNA參與調(diào)控腫瘤的多種生理過程，包括細(xì)胞增殖、藥物抗性、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成[17-18]。目前針對miRNAs的研究集中于癌癥特異性miRNA和相關(guān)靶基因，以期闡明癌癥發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制[19-20]。miR-150是一種癌癥相關(guān)的miRNA，在各種癌癥中異常表達(dá)[21-22]。Zhang等[23]報(bào)道，miR-150在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞中上調(diào)并且與存活顯著相關(guān)，并且miR-150表達(dá)增加促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移。Chen等[24]驗(yàn)證了過表達(dá)miR-150-5p在體外/體內(nèi)均抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成，而下調(diào)miR-150-5p在體外促進(jìn)了結(jié)直腸癌的進(jìn)展。本研究證實(shí)，與正常組織相比，宮頸癌組織中miR-150表達(dá)顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-150類似物至宮頸癌細(xì)胞(SiHa/HeLa)后，宮頸癌細(xì)胞的增殖速度顯著降低，宮頸癌細(xì)胞形成了大量酸性自噬溶酶體液泡并出現(xiàn)了早期細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，即細(xì)胞核破碎，核膜受損，這提示miR-150可抑制細(xì)胞增殖并增加宮頸癌細(xì)胞的自噬及凋亡。這些結(jié)果表明，miR-150可能在宮頸癌中發(fā)揮著腫瘤抑制的作用，進(jìn)一步分析miR-150的靶位點(diǎn)以確定miR-150在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中潛在的分子機(jī)制。

生物信息學(xué)分析預(yù)測MUC4為miR-150的潛在靶標(biāo)。MUC4是一種高分子量的I型跨膜蛋白，在多種癌癥中異常表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和膀胱癌，并且在功能上與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用有關(guān)[25]。MUC4在胰腺癌中過度表達(dá)，并有助于胰腺癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移[26-27]。MUC4還在卵巢癌中過度表達(dá)并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的病理生物學(xué)和侵襲性[28]。MUC4在腫瘤發(fā)生過程中的腸細(xì)胞增殖中也起著關(guān)鍵作用[29]。Rowson-Hodel等[30]研究表明，異常表達(dá)的MUC4可導(dǎo)致增加乳腺癌的轉(zhuǎn)移效率。這些結(jié)果表明，根據(jù)特定的癌癥和細(xì)胞環(huán)境，MUC4的作用似乎很復(fù)雜。因此，MUC4在人類腫瘤中的表達(dá)和功能尚不清楚。研究表明，miRNA長度約為20nt，在發(fā)揮功能前會誘導(dǎo)形成沉默復(fù)合物(miRISC)，該復(fù)合物通過堿基互補(bǔ)的方式與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合，導(dǎo)致它們的翻譯抑制、去腺苷酸化和衰變，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[31-32]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測并通過人工合成miR-150類似物轉(zhuǎn)染人類宮頸癌細(xì)胞，證明miR-150可能通過靶向結(jié)合MUC4基因的3'-UTR區(qū)域，抑制其基因表達(dá)。由于miR-150的靶基因眾多，需進(jìn)一步研究miR-150通過宮頸癌中的MUC4作為腫瘤抑制因子的功能。

綜上所述，miR-150具有抗腫瘤特性并抑制宮頸癌細(xì)胞的生長與侵襲，增加宮頸癌細(xì)胞的自噬。miR-150可直接靶向MUC4，其可能是通過下調(diào)MUC4進(jìn)而調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究可為宮頸癌的診斷和治療策略提供新的見解。