涂鈺瑩 易英 涂玉梅 龍孝斌

聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞的死亡主要是由于聽(tīng)覺(jué)創(chuàng)傷、噪音暴露、年齡老化、化學(xué)損傷或暴露于某些藥物，從而導(dǎo)致永久性的聽(tīng)覺(jué)障礙[1]。哺乳動(dòng)物內(nèi)耳中的毛細(xì)胞對(duì)抗癌鉑類和氨基糖苷類抗生素藥物等化合物敏感。順鉑是臨床上治療多種人類疾病最常用的化療藥物之一，然而由于順鉑治療后產(chǎn)生的腎毒性和耳毒性以及神經(jīng)毒性等毒副作用, 尤其是劑量依賴性的順鉑耳毒性，其臨床應(yīng)用受到一定的限制。

糖皮質(zhì)激素特別是地塞米松被引入腫瘤治療, 不僅因?yàn)槠鋵?duì)淋巴細(xì)胞有促凋亡的作用, 同時(shí)還能治療因腫瘤引發(fā)的水腫、炎癥、疼痛及電解質(zhì)失衡等方面的副作用，更重要的是地塞米松還能預(yù)防因藥物細(xì)胞毒性作用所引發(fā)的惡心和嘔吐[2,3]， 以及緩解血管內(nèi)皮水腫、增加內(nèi)耳血供，所以臨床化療常聯(lián)合使用地塞米松。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明豚鼠鼓室內(nèi)注射地塞米松可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低耳蝸組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)含量、增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性，提高內(nèi)耳細(xì)胞清除氧自由基的能力，可減輕順鉑導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)，達(dá)到保護(hù)內(nèi)耳的作用[4]。故本研究擬觀察地塞米松能否保護(hù)順鉑導(dǎo)致的斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷，能否減少因順鉑導(dǎo)致的活性氧產(chǎn)生并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化程度，為順鉑耳毒性的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本實(shí)驗(yàn)所采用的野生型AB品系斑馬魚(yú)來(lái)源于華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，由基因工程研究所發(fā)育生物學(xué)教研室所贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前挑選成年斑馬魚(yú)(雌雄比為2∶1)放置于裝有系統(tǒng)水的培育缸內(nèi)，第二天8：00光源自動(dòng)打開(kāi)后，雌雄魚(yú)在燈光刺激下開(kāi)始進(jìn)行交配產(chǎn)卵，取出魚(yú)卵清洗干凈轉(zhuǎn)移至28.5℃恒溫箱內(nèi)孵育。挑選發(fā)育正常的受精后5天(5dpf)斑馬魚(yú)幼魚(yú)隨機(jī)分成3組，分別為對(duì)照組、順鉑組、順鉑+地塞米松組，每組10條。

1.2主要試劑與儀器 地塞米松(美國(guó)Sigma公司)：用1%的二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為25 μmol/L的儲(chǔ)備液，-25℃保存；將順鉑粉末(美國(guó)Sigma公司)溶解于ddH2O中，順鉑溶液儲(chǔ)存濃度為50 μmol/L，置于-20℃避光保存?zhèn)溆?；DCFH-DA、DPPP熒光分子探針、FM1-43FX染液(美國(guó)Sigma公司)；體式顯微鏡(Olympus，MVX10)、正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)、熒光定量PCR儀(Roche，LightCycler Nano)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1順鉑耳毒性斑魚(yú)模型建立及斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 前期研究發(fā)現(xiàn)50 μmol/L順鉑處理24小時(shí)足夠?qū)⒂佐~(yú)側(cè)線毛細(xì)胞破壞徹底而不導(dǎo)致幼魚(yú)活性明顯下降[5]，故沿用該濃度時(shí)間組合建立斑馬魚(yú)順鉑耳毒性模型。對(duì)照組幼魚(yú)置于系統(tǒng)水中；順鉑組幼魚(yú)置于50 μmol/L濃度的順鉑溶液中遮光處理24 h；順鉑+地塞米松組幼魚(yú)置于25 μmol/L的地塞米松中遮光預(yù)處理24 h，用PBS溶液漂洗幼魚(yú)3次，每次5分鐘，再將其置于50 μmol/L濃度的順鉑溶液中遮光處理24 h。待處理結(jié)束后，移除順鉑溶液，用PBS溶液漂洗幼魚(yú)3次，每次5分鐘；更換新鮮的系統(tǒng)水，然后于移除順鉑后6、12、24、48 h，每組分別取10條幼魚(yú)置于2 μmol/L濃度的FM1-43FX染液遮光處理45 s，移除染液，用PBST溶液漂洗幼魚(yú)3次，每次5分鐘；PFA固定2 h，移除后加入70%甘油保存。采用熒光染料FM1-43FX對(duì)斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞細(xì)胞膜進(jìn)行特異性染色。在熒光顯微鏡高倍鏡下觀察斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘P1-P9平均毛細(xì)胞的數(shù)目。

1.3.2ROS水平檢測(cè) 每組的前期處理按上述步驟操作，每組10條置于盛有系統(tǒng)水的6孔板里，在移除順鉑6 h后，對(duì)每組斑馬魚(yú)以25 μg/mL的DCFH-DA探針處理，黑暗28.5℃下培養(yǎng)1 h，1 h后用PBST淋洗數(shù)次，用0.02%tricaine(MS222)溶液麻醉后置于體式熒光顯微鏡下拍照，并計(jì)算其熒光強(qiáng)度，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。

1.3.3脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)測(cè)檢 同上操作，10條斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于盛有系統(tǒng)水的6孔板里，每組斑馬魚(yú)以25 μg/ml的DPPP處理后，黑暗28.5℃下培養(yǎng)1 h，然后用PBST淋洗數(shù)次，用0.02%tricaine(MS222)溶液麻醉后置于體式熒光顯微鏡下拍照，DPPP在體內(nèi)與脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)后發(fā)出藍(lán)色熒光，其熒光強(qiáng)度可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，計(jì)算其藍(lán)色熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與體內(nèi)MDA含量呈正比。

1.3.4斑馬魚(yú)RNA提取 在移除順鉑6 h后分別收集三組胚胎放入 EP 管中，每管約20尾，加入 500 μl Trizol，用一次性1 ml無(wú)菌注射器反復(fù)抽吸；室溫靜置 5 min 后，加入 100 μl 三氯甲烷，劇烈振蕩 20 s； 離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速4℃離心 15 min；此時(shí)液體分三層,轉(zhuǎn)移最上層水相至新管中，加入等體積異丙醇或兩倍體積乙醇，震蕩混勻；離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速4℃離心15 min；去上清，加入 1 ml無(wú)RNase的75%乙醇，最高轉(zhuǎn)速4℃離心5 min；去上清，室溫靜置 3～5 min 晾干，加入30 μl無(wú)RNase的H2O溶解RNA；使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，于-80℃保存。

1.3.5斑馬魚(yú)幼魚(yú)cDNA的制備 三組均分別取2 μgRNA，加入1 μl Oligo dT；于70℃加熱 5 min 后，立即置于冰上冷卻；反轉(zhuǎn)錄體系包括：Total RNA+Oligo dT≤13 μl、5×buffer 5 μl、dNTP(2.5 mM) 5 μl、RNase Inhibitor 1 μl、Reverse transcriptase 1 μl、DEPC H2O up to 25 μl。反應(yīng)體系混勻后 42℃孵育 1 h，于-20℃長(zhǎng)期保存。

1.3.6抗氧化物酶基因檢測(cè) 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)抗氧化酶基因sodl、catl、gstr的表達(dá)水平。qPCR使用2×Master mix試劑盒在Roche實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸17 s，45個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計(jì)算，內(nèi)參基因?yàn)閑f1a。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用Levene’s檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性分析，使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),三組比較采用單因素方差分析，設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組斑馬魚(yú)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞熒光染色及計(jì)數(shù)比較 經(jīng)FM1-43FX染色后，可見(jiàn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)體表規(guī)律排列著紅色光點(diǎn)(圖1)，移除順鉑后6、12、24、48 h三組P1-P9神經(jīng)丘平均毛細(xì)胞數(shù)目見(jiàn)表2，可見(jiàn)第6、12和24 h時(shí)，三組神經(jīng)丘毛細(xì)胞平均計(jì)數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P<0.5),順鉑組、順鉑+地塞米松組神經(jīng)毛細(xì)胞平均計(jì)數(shù)均低于對(duì)照組，且順鉑組毛細(xì)胞平均計(jì)數(shù)明顯低于順鉑+地塞米松組；移除順鉑后6 h，三組間神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)目差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而在移除順鉑后48 h時(shí)，順鉑組、順鉑+地塞米松組平均神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)平均計(jì)數(shù)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但順鉑+地塞米松組神經(jīng)丘毛細(xì)胞平均計(jì)數(shù)高于順鉑組，表明地塞米松預(yù)處理后，能改善順鉑導(dǎo)致的斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷。

表2 各組移除順鉑后不同時(shí)間神經(jīng)丘毛細(xì)胞平均計(jì)數(shù)(個(gè)，

2.2移除順鉑6 h后各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)ROS免疫熒光染色比較 如圖2所示,移除順鉑6 h后，斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧含量增加，順鉑組幼魚(yú)熒光強(qiáng)度顯著高于其余兩組，分別為對(duì)照組和順鉑+地塞米松組的2.11倍和1.50倍(P<0.05)；順鉑+地塞米松組熒光強(qiáng)度為對(duì)照組的1.42倍(表3)?？梢?jiàn)地塞米松有效改善了順鉑導(dǎo)致的活性氧含量增加，進(jìn)一步說(shuō)明地塞米松能降低斑馬魚(yú)幼魚(yú)氧化應(yīng)激水平。

表3 各組斑馬幼魚(yú)體內(nèi)ROS、MDA平均熒光強(qiáng)度

2.3移除順鉑6 h各組斑馬魚(yú)體內(nèi)MDA的DPPP熒光染色比較 如圖3所示，順鉑組熒光染色最強(qiáng)，其次是順鉑+地塞米松組，染色最強(qiáng)的是對(duì)照組；順鉑組熒光強(qiáng)度分別是對(duì)照組和順鉑+地塞米松組的3.33倍和1.57倍(P<0.05);但順鉑+地塞米松組熒光強(qiáng)度與對(duì)照組差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.4移除順鉑6 h后各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)抗氧化物酶基因sodl、catl、gstr表達(dá)比較 如表4所示，順鉑組、順鉑+地塞米松組與對(duì)照組相比，cat1基因表達(dá)水平明顯降低，且順鉑+地塞米松組cat1基因表達(dá)水平明顯高于順鉑組(均為P<0.05)。；順鉑組sod1基因表達(dá)水平低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，順鉑組與順鉑+地塞米松組sod1基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組間gstr基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組斑馬魚(yú)幼魚(yú)抗氧化基因catl、sodl、gstr相對(duì)表達(dá)量

3 討論

順鉑誘導(dǎo)的耳毒性的特征為雙側(cè)、不可逆和劑量依賴性聽(tīng)力損失，其最初影響高頻并且可能伴有耳鳴[6]。大約60%～80%的順鉑治療患者聽(tīng)覺(jué)閾值升高，15%的患者有明顯的聽(tīng)力損失[7]。聽(tīng)力損失主要由毛細(xì)胞損傷導(dǎo)致，致毛細(xì)胞損傷的因素復(fù)雜多樣，相關(guān)機(jī)制也種類不一，最常見(jiàn)的是細(xì)胞凋亡或壞死途徑，順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，主要通過(guò)氧化應(yīng)激和炎癥[8]兩個(gè)過(guò)程引起細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。成年哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞雖無(wú)法再生，但雞耳蝸毛細(xì)胞和斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞具有再生能力。毛細(xì)胞再生有兩種機(jī)制，一是通過(guò)有絲分裂再生，支持細(xì)胞分裂成一個(gè)或兩個(gè)子細(xì)胞，再分化為毛細(xì)胞；二是通過(guò)支持細(xì)胞表型直接轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞而不進(jìn)行有絲分裂，這種現(xiàn)象稱為直接轉(zhuǎn)分化[9]。本實(shí)驗(yàn)中移除順鉑后48小時(shí)，可觀察到順鉑組斑馬魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞逐漸恢復(fù)至正常，這是因?yàn)榍捌谘芯恳寻l(fā)現(xiàn)神經(jīng)丘周圍支持細(xì)胞增殖狀態(tài)活躍，新增的毛細(xì)胞主要由支持細(xì)胞增殖后再分化為毛細(xì)胞[10]；但在移除順鉑后6、12和24 h，觀察到順鉑+地塞米松組單個(gè)神經(jīng)丘毛細(xì)胞均數(shù)高于順鉑組，且在移除順鉑后6 h觀察到與順鉑組相比，順鉑+地塞米松組平均神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)增加了約2.2倍(P<0.01)，表明地塞米松預(yù)處理可明顯改善順鉑導(dǎo)致的毛細(xì)胞耳毒性。

既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明地塞米松在順鉑損傷過(guò)程中起保護(hù)作用，Dinh等[11]認(rèn)為地塞米松通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平和NADPH-氧化酶-3(NOX-3)水平，在體外保護(hù)大鼠Corti外植體器官免受順鉑誘導(dǎo)的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞損失。ROS水平上升使血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子，從而破壞緊密連接，導(dǎo)致內(nèi)耳液體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的紊亂，破壞耳蝸潛能，從而導(dǎo)致Corti器官細(xì)胞系的凋亡；據(jù)報(bào)道，糖皮質(zhì)激素會(huì)在內(nèi)皮細(xì)胞之間產(chǎn)生新的緊密連接，從而恢復(fù)血管紋中的內(nèi)皮功能[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，采取了濃度為25 μM的地塞米松，這是由于Hayward等[13]測(cè)試了一系列濃度的地塞米松后，確定了10 μM為最有效但毒性最低的濃度，且濃度在25 μM時(shí)經(jīng)常觀察到顯著效果，故而在斑馬魚(yú)研究中常用此濃度。

DCFH-DA熒光探針本身沒(méi)有熒光，但能自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能輕易穿透細(xì)胞膜，故而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成綠色熒光物質(zhì)DCF，與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比；ROS在細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生，并被內(nèi)在細(xì)胞清除系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽還原酶)所還原。ROS的增加導(dǎo)致耳蝸組織中谷胱甘肽和抗氧化酶的消耗，可能導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞內(nèi)的超氧化物、過(guò)氧化氫和有毒脂質(zhì)的增加[14]，大量脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生后可改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)改變。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，它在生物體內(nèi)含量的高低可指示機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平，能間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度[15]。如上所述，ROS產(chǎn)生增加的最終結(jié)果是促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡，表明ROS在順鉑誘導(dǎo)的耳毒性中起關(guān)鍵作用，對(duì)其抑制可以改善順鉑導(dǎo)致的聽(tīng)力損傷[6]。本研究結(jié)果顯示與順鉑+地塞米松組相比，順鉑組斑馬魚(yú)體內(nèi)活性氧含量和MDA含量分別增加了1.5倍和1.57倍，表明地塞米松可以降低順鉑導(dǎo)致的斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧含量和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而起到保護(hù)毛細(xì)胞的作用。此外，文中結(jié)果顯示順鉑組cat1、sod1基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比下調(diào)，可能因?yàn)轫樸K導(dǎo)致斑馬魚(yú)組織中O2-增多，過(guò)多的O2-不能及時(shí)清除，對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生了氧化損傷；而順鉑+地塞米松組gstr基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，說(shuō)明地塞米松的抗氧化作用導(dǎo)致體內(nèi)部分抗氧化物酶活性增高。

綜上所述，本研究結(jié)果表明地塞米松可以減弱順鉑導(dǎo)致的斑馬魚(yú)毛細(xì)胞耳毒性，降低斑馬魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)活性氧含量、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化程度，同時(shí)可上調(diào)部分抗氧化物酶基因活性，從而保護(hù)斑馬魚(yú)幼魚(yú)毛細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響。本研究的不足之處在于未能使用地塞米松的抑制劑作為對(duì)照，不能完全排除是否有其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，在今后的實(shí)驗(yàn)中仍需要進(jìn)一步研究。