王璐，孫小虎，白靜慧，朱相宇，王琬婷

結直腸癌占大腸癌的63%，外科手術聯(lián)合輔助療法，包括化學療法和靶向療法，是結直腸癌治療的主要形式，但其術后復發(fā)率高達30%[1-2]。因此，有必要進一步研究結直腸癌進展的分子機制并尋找新的治療靶點。miRNA是一類小的非編碼RNA，可通過抑制核糖體功能或促進靶mRNA的降解來調節(jié)轉錄后基因的表達水平[3]。致癌miRNA的上調和抑癌性miRNA的下調均可在癌變過程中發(fā)揮關鍵作用。miR-584是miR-584/miR-656簇的成員，研究表明，miR-584的表達不足會促進HuCCT1人肝內膽管癌細胞系中EGF介導的遷移[4]；miR-584通過靶向激活素受體樣激酶7(ALK7)來調節(jié)卵巢癌細胞的增殖、凋亡和侵襲[5]。miR-584也與惡性腫瘤的轉移和復發(fā)密切相關，包括頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、肺癌等[6]。但是，miR-584調控結直腸癌的功能和相關的分子機制仍然未知。CCN2基因屬于同源異型框基因的超家族，其對主要細胞過程(包括細胞識別、生長和分化)具有重要作用。CCN2家族的基因在白血病、黑色素瘤及乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、食管癌和前列腺癌中高表達[7]。此外，在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中還觀察到CCN2基因的異常表達[8]。以往研究已經(jīng)證明CCN2在OSCC中過表達，并且其在HaCAT人上皮細胞系中的表達增加顯著促進了細胞增殖。除調節(jié)細胞增殖外，CCN2B7還影響許多其他細胞過程，包括細胞侵襲、DNA修復、轉移和血管生成[9]，這些過程與乳腺癌和結直腸癌患者的生存期較差有關。本研究擬探討miR-584調節(jié)CCN2對結直腸癌SW1116細胞增殖、侵襲的影響，為結直腸癌的治療提供依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞：人類SW1116癌細胞來自湘雅醫(yī)學院細胞中心(長沙，中國)。(2)試藥試劑：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT，中國碧云天生物科技公司)試劑盒,膜聯(lián)蛋白-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國sigma生物科技公司),Transwell chamber(8 mm孔徑，美國紐約州康寧公司)；Hybrid-RTMmiRNA試劑盒(韓國GeneAll公司),DNase試劑盒(日本TaKaRa公司),RevertAid逆轉錄酶(美國Thermofisher公司),SYBR預混物ExTaq Ⅱ(日本TaKaRa公司),Pierce RAPI Buffer、Halt Protease Inhibitor Cocktail、二辛可寧酸試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司),10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，中國碧云天生物科技公司),聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司),CCN2(1∶1 000)一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(英國Abcam公司),SuperSignalWest Pico化學發(fā)光底物(美國Thermo Fisher Scientific公司)。(3)儀器設備：Multiscan Plate Reader酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),NanoDrop光譜儀(美國Thermo Scientific公司),ABI PRISM 7500儀器(美國Applied Biosystems公司),ImageJ 1.50i(美國國立衛(wèi)生研究院)。

1.2 實驗方法 2020年1—4月于遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實驗室進行實驗， 將SW1116癌細胞在補充有10% FBS和青霉素/鏈霉素的Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境：5% CO2、37 ℃、95% N2,當細胞融合率達到60%～70%時，用于后續(xù)實驗。取培養(yǎng)后的SW1116癌細胞，分為miR-NC組、miR-584 mimics組、miR-584抑制劑組。培養(yǎng)方法：miRNA載體包括miR-NC(空白載體)，miRNA-584過表達載體(miR-584 mimics)，miRNA-584低表達載體(miR-584抑制劑)購自廣州Ribo Bio公司。其載體序列分別為：5′-TGCGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGA-3′；5′-CGTCGCTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGATCGTACGTGC-3′。使用Lipofectamine 2000試劑根據(jù)不同質粒進行差異轉染。以上各組細胞每孔設6個平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 SW1116癌細胞活力檢測：采用MTT法檢測SW1116癌細胞活力。在96孔板中孵育培養(yǎng)結束的SW1116細胞72 h后，將MTT溶液添加到每個孔中孵育4 h。與二甲基亞砜孵育10 min后，使用Multiscan Plate Reader測量570 nm處的吸光度，并繪制細胞活力曲線。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(結腸癌HT-29細胞組OD-空白組OD)。

1.3.2 SW1116癌細胞單克隆形成數(shù)目檢測：結晶紫染色檢測單克隆形成數(shù)。將300個SW1116癌細胞接種在含有10%FBS培養(yǎng)基2 ml的6孔板中。并在37℃下培養(yǎng)9 d。洗滌菌落并用甲醇固定30 min。然后，用結晶紫溶液將菌落染色20 min。拍攝菌落并計算數(shù)量。

1.3.3 SW1116癌細胞凋亡測定：膜聯(lián)蛋白-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測SW1116細胞凋亡。胰蛋白酶消化收集癌細胞，在PBS中洗滌2次，并重懸于結合緩沖液500 μl中，然后加入膜聯(lián)蛋白V-FITC 5 μl和PI 5 μl。在室溫下黑暗中孵育10 min后，用流式細胞儀分析熒光。

1.3.4 SW1116癌細胞遷移、侵襲水平測定：使用Transwell測定法測量細胞侵襲。將 SW1116細胞接種到Transwell chamber的上腔中。上腔室包含無血清培養(yǎng)基，而下腔室填充有含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。溫育48 h后，將侵襲的細胞在甲醇中固定并用結晶紫染色, 在顯微鏡下計數(shù)來自5個隨機視野的細胞。

1.3.5 SW1116癌細胞中miR-584、CCN2 mRNA基因表達水平測定：采用RT-PCR法測定miR-584、CCN2 mRNA基因表達水平。使用Hybrid-RTMmiRNA試劑盒從培養(yǎng)結束的SW1116癌細胞中提取總RNA。根據(jù)260/280吸光度比確定提取的RNA質量，并通過NanoDrop光譜儀進行測量。通過RevertAid逆轉錄酶合成cDNA。miR-584、CCN2、GAPDH引物使用Oligo引物分析軟件(美國DBA Oligo)設計，序列如下：miR-584上游引物：5' -TGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTA

GCTGATCGATCGTAGCTAGCTAG-3'，下游引物：5' -CGTAGCTAGCTAGCTGCTAGTCGACTGATCGTCGATGCTA

GCTCGTCG-3'。CCN2上游引物：5' -TCGATCGATCGAT

CGCTAGCTCGATCGATCGATGCTAG-3'，下游引物：5' -TGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGC

TAGCTAG-3'。GAPDH上游引物：5' -TCGATCGATCGA

TCGATCGATCGATCGATCGATCGATGC-3'，下游引物：5' -

CGTCGATCGATCGATCGATCGTAGCTAGCTAGGGTCG

ATCC-3'。實時定量PCR反應通過使用ABI PRISM 7500儀器的標準規(guī)程一式3份進行。將cDNA產物添加到預混合物中，該預混合物包含10 pmol/μl的每種miR-584、CCN2、GAPDH引物和2 μl的SYBR預混物ExTaq Ⅱ?；?-ΔΔCT方法計算miR-584、CCN2 表達量。PCR程序條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s和72 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。GAPDH為內參。

1.3.6 SW1116癌細胞CCN2蛋白表達水平測定：蛋白印記法測定CCN2蛋白表達水平。使用Pierce RAPI Buffer和Halt Protease Inhibitor Cocktail的混合物以100∶1的比例裂解細胞。通過二辛可寧酸測定法測量蛋白質濃度。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，然后將其轉移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，并與抗CCN2的一抗在4 ℃孵育過夜;然后將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在37 ℃下孵育2 h。SuperSignalWest Pico化學發(fā)光底物用于可視化蛋白條帶。使用ImageJ 1.50i定量蛋白質條帶。

2 結 果

2.1 各組SW1116直腸癌細胞OD值、存活率比較 與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組OD值、存活率降低，miR-584抑制劑組OD值、存活率升高(t=17.965、19.654、20.365、25.654)；與miR-584 mimics組比較，miR-584抑制劑組OD值、存活率升高(t=16.854、19.634，均P=0.000)。SW1116直腸癌細胞組與miR-NC組OD值、存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.895、1.265，P>0.05)，見表1。

表1 各組SW1116直腸癌細胞OD值、存活率比較Tab.1 Comparison of OD value and survival rateof SW1116 rectal cancer cells in each group

2.2 各組SW1116直腸癌細胞單克隆形成數(shù)目比較 與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組單克隆形成數(shù)目降低，miR-584抑制劑組單克隆形成數(shù)目升高(t=16.549、20.218，均P=0.000)；與miR-584 mimics組比較，miR-584抑制劑組單克隆形成數(shù)目升高(t=18.532，P=0.000)。SW1116直腸癌細胞組與miR-NC組單克隆形成數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.277，P>0.05)，見表2、圖1。

圖1 各組SW1116直腸癌細胞單克隆形成數(shù)目比較(結晶紫染色，×200)

表2 各組SW1116直腸癌細胞克隆形成數(shù)目比較個)

2.3 各組SW1116直腸癌細胞凋亡率比較 與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組細胞凋亡率升高，miR-584抑制劑組細胞凋亡率降低(t=23.654、24.148，均P=0.000)；與miR-584 mimics組比較，miR-584抑制劑組細胞凋亡率降低(t=35.951，P=0.000)。SW1116直腸癌細胞組與miR-NC組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.014，P>0.05)，見表3、圖2。

圖2 各組SW1116直腸癌細胞凋亡率的比較

表3 各組SW1116直腸癌細胞凋亡率比較Tab.3 Comparison of apoptosis rateof SW1116 rectal cancer cells in each group

2.4 各組SW1116直腸癌細胞遷移能力比較 與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組穿膜數(shù)降低，miR-584抑制劑組穿膜數(shù)升高(t=19.658、27.130，均P=0.000)；與miR-584 mimics組比較，miR-584抑制劑組穿膜數(shù)升高(t=24.547，P=0.000)。SW1116直腸癌細胞組與miR-NC組穿膜數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.659，P>0.05)，見表4、圖3。

圖3 各組SW1116直腸癌細胞穿膜數(shù)比較(結晶紫染色，×200)

表4 各組SW1116直腸癌細胞穿膜數(shù)比較個)Tab.4 Comparison of transmembrane numberof SW1116 rectal cancer cells in each group

2.5 各組SW1116直腸癌細胞miR-584、CCN2 mRNA表達水平比較 與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組細胞miR-584升高，CCN2 mRNA降低(t=27.549、19.254，均P=0.000)，miR-584抑制劑組細胞miR-584降低，CCN2 mRNA升高(t=23.149、18.149，均P=0.000)；與miR-584 mimics組比較，miR-584抑制劑組細胞miR-584降低，CCN2 mRNA升高(t=28.654、26.254，均P=0.000)。SW1116直腸癌細胞組與miR-NC組miR-584、CCN2 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.214、0.998，P>0.05)，見表5。

表5 各組SW1116直腸癌細胞miR-584、CCN2 mRNA表達水平比較Tab.5 Comparison of miR-584 and CCN2 mRNAexpression levels in SW1116 rectal cancer cells in each group

2.6 各組SW1116直腸癌細胞CCN2蛋白表達水平比較 與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組細胞CCN2蛋白降低(t=28.654，均P=0.000)，miR-584抑制劑組細胞CCN2蛋白升高(t=18.547，均P=0.000)；與miR-584 mimics組比較，miR-584抑制劑組細胞CCN2蛋白升高(t=19.965，均P=0.000)。SW1116直腸癌細胞組與miR-NC組CCN2 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.029，P>0.05)，見表6、圖4。

表6 各組SW1116直腸癌細胞CCN2蛋白表達水平比較Tab.6 Comparison of CCN2 proteinexpression levels in SW1116 rectal cancer cells in each group

注：A.SW1116直腸癌細胞組；B.miR-NC組；C.miR-584 mimics組；D.miR-584抑制劑組

3 討 論

越來越多的研究報道，與乳腺癌和胰腺癌等正常組織比較，癌組織中miR-584表達下調[10]。同樣，miR-584在肺癌組織中的表達降低，并與肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲相關[11]。本研究表明，與SW1116直腸癌細胞組比較，miR-584 mimics組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)降低，miR-584抑制劑組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)升高(P<0.05)，表明miR-584抑制癌細胞增殖、生長、侵襲，促進結直腸癌細胞的凋亡。因此，本研究結果表明，恢復miR-584表達水平可能是治療結直腸癌的新型靶點。對其他腫瘤類型的研究，例如神經(jīng)膠質瘤、胃癌和非小細胞肺癌，表明miR-584是一種腫瘤促進因子，miR-584在腫瘤抑制中可能具有不同的作用[12]。鑒于此，對于不同的腫瘤，應嚴格評估m(xù)iR-584的體內性質。

CCN2基因位于4q22號染色體上，是果蠅基因的同源物，可調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞。在肝癌細胞中，CCN2的上調通過延長G0/G1期并促進細胞增殖、遷移和侵襲[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制CCN2可抑制SW1116直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，且臨床研究表明，癌組織中CCN2的高表達與結直腸癌患者的預后不良有關。這些發(fā)現(xiàn)表明，CCN2功能的抑制似乎是直腸癌一種新的治療方法。研究表明[14]，小鼠腸道特異性過表達CCN2導致JNK1磷酸化水平升高。JNK1途徑的激活在結腸上皮的癌變過程中具有重要作用。JNK1途徑的激活可以促進腫瘤的形成，維持上皮的分化和突變細胞的生長。體外細胞實驗證實，CCN2的上調增加了JNK1的磷酸化[15]。MUC2是杯狀細胞的標志物，杯狀細胞的損失表達抑制了腸道分泌細胞的分化。以往研究表明，CCN2可以增加結腸癌發(fā)生過程中MUC2的表達。

使用上游miRNA抑制劑/恢復劑(miR-mimics/inhibitor)是調控CCN2功能的可行方法。在一些臨床前研究中已經(jīng)證實了miRNA抑制劑/恢復劑(miR-mimics/inhibitor)的治療潛力。研究表明[16-17]，抗miR-584通過上調miR-584靶標來增加A549細胞對紫杉醇的敏感性，并且在A549異種移植小鼠模型中證明了腫瘤消退，延長的生存期和miR-584靶標上調；靶向過表達miR-584改善了血小板源性生長因子C轉基因小鼠的肝纖維化和腫瘤發(fā)生率[18-19]；用鎖定的核酸阻斷miR-584可以誘導人急性巨核細胞白血病中的細胞凋亡并阻止細胞增殖。此外，抗miRs的治療方法已經(jīng)進行了一些成功的Ⅰ期試驗和正在進行的Ⅱ期試驗，用于治療肝炎皮膚T細胞淋巴瘤、肝炎和2型糖尿病[20]。研究已表明[21]，miR-584 mimics能靶向抑制結直癌細胞CCN2表達，這與上述討論一致。

綜上所述，miR-584能抑制結直腸癌SW1116細胞增殖、侵襲，其機制可能與miR-584下調CCN2的表達有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王璐：論文撰寫及修改；孫小虎：參與實驗過程，分析實驗數(shù)據(jù)；白靜慧：設計研究方案，主導實施研究；朱相宇、王琬婷：資料搜集整理等輔助性工作