馬曉蓉，楊淑娟，姚 寧，王玲霞，馬 強，梁文裕

(寧夏大學 生命科學學院, 銀川 750021)

葉和根作為植物主要的營養(yǎng)器官，承擔著重要的生理功能。研究表明，鹽脅迫會對植物葉肉細胞葉綠體和線粒體的結構產生明顯影響[1-2],如白三葉在堿性鹽脅迫下葉片葉綠體內部的基粒片層膨脹解體，排列疏松，部分模糊不清，基粒片層層數減少[3]。隨著鹽脅迫加重，秀麗四照花葉綠體內的淀粉粒、脂滴、噬鋨顆粒數量增多,基粒片層結構松散、腫脹[4]。桉樹在鹽脅迫下葉綠體出現超大淀粉粒，類囊體膜發(fā)生擴張[5]，而且鹽脅迫條件下甘薯葉片線粒體內膜嵴腫脹[6]。因此，鹽脅迫對植物葉綠體和線粒體具有明顯的傷害作用。此外，作為植物最早感受鹽脅迫的器官，根系對鹽脅迫也異常敏感，如鹽脅迫下小麥通過降低根系總的吸收面，增強根系活力，提高對K+的吸收能力等途徑來適應鹽脅迫[7]。鹽脅迫下大麥根尖分生區(qū)細胞中內質網和高爾基體豐富，質體和線粒體大量出現[8]。因此，鹽脅迫下根的生長發(fā)育和結構變化直接反映了植物對鹽脅迫的響應程度和耐受能力。

寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)是茄科枸杞屬多年生落葉灌木，具有較強的耐鹽堿能力[9]。結果表明，隨著鹽濃度的增加，枸杞根系質膜和液泡膜H+-ATPase活性逐漸升高，且液泡膜H+-ATPase活性高于質膜H+-ATPase活性[10]。陳金龍[11]用不同濃度鹽溶液處理枸杞后發(fā)現，隨著鹽濃度的增加，植株生物量下降；葉綠素含量、過氧化物酶活性，可溶性蛋白先增后降；脯氨酸、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性一直增加。枸杞幼苗葉綠素含量、氣孔導度、凈光合速率和蒸騰速率等光合作用參數隨著鹽濃度的增大而受到顯著抑制[12]。此外，毛桂蓮等[13]對NaHCO3脅迫條件下寧夏枸杞葉的結構變化研究表明，隨著脅迫濃度增加，葉綠體結構破壞，基粒片層排列紊亂，淀粉粒增多，柵欄組織的細胞結構緊密度逐漸降低，層數逐級減少。因此，高濃度的鹽脅迫對寧夏枸杞的生理和結構均產生了顯著影響。

寧夏枸杞作為著名的耐鹽藥用植物，其耐鹽機制的研究主要集中在生理及分子生物學領域[6-12]。由于植物耐鹽機制是其結構、生理和分子調控的綜合反應，因此，研究NaCl脅迫下寧夏枸杞器官和細胞的結構變化對深入解析寧夏枸杞耐鹽機制具有重要意義。目前，NaHCO3脅迫條件下寧夏枸杞葉的結構變化研究已有報道，但NaCl脅迫下寧夏枸杞葉和幼根細胞超微結構的變化并未明確。因此，本研究通過分析寧夏枸杞在NaCl脅迫條件下葉片和幼根細胞顯微及超微結構的變化，闡明寧夏枸杞響應NaCl脅迫的結構基礎，為深入研究寧夏枸杞耐鹽機理和培育耐鹽新品種提供理論基礎和科學依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

以寧夏枸杞“寧杞1號”為試驗材料，將飽滿種子用蒸餾水沖洗后萌發(fā)5 d，栽植在珍珠巖∶蛭石∶基質為1∶1∶1比例混合的穴盤中，用Hoagland營養(yǎng)液澆灌，在溫度(25±2)℃，濕度42%，光強700 μmol·m-2·s-1，光照時間16 h的條件下進行人工室內培養(yǎng)。培養(yǎng)1個月后，選擇長勢一致、健康的幼苗移植進行水培，再水培2個月后，進行試驗處理。本試驗設置4組處理：0 mmol/L NaCl為對照組，100、200和300 mmol/L NaCl為處理組，每個處理重復3次。分別在NaCl處理后第7天取樣。

1.2 方 法

用鋒利刀片取不同NaCl濃度處理的新鮮完整的寧夏枸杞葉片和幼根組織各15塊(葉片取自同一部位的功能葉，幼根取自距離根尖3～5 mm處)，每塊組織小于1 mm3。將葉片和幼根組織放入2.5%的戊二醛中固定3 h后，用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗滌3次，每次15 min。浸入到1%鋨酸中固定3 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗滌3次，每次15 min。分別在10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%丙酮中依次各進行20 min脫水處理，然后在100%的丙酮中放置3次，每次30 min。100%丙酮+Epon812樹脂(3∶1)室溫放置2 h；100%丙酮+Epon812樹脂(1∶1)室溫放置4 h；100%丙酮+Epon812樹脂(1∶3)室溫過夜，整個過程需要封口并在搖床上進行。往包埋板內倒入少許包埋劑，將樣品用牙簽挑起一小塊倒包埋板內在干燥器中放置12 h后，45 ℃烘箱內放置3 h，60 ℃烘箱內放置24 h。

將樣品進行修塊，用Leica EM UC6超薄切片機切片，然后用Leica DM500顯微鏡進行觀察、定位和顯微結構照相，最后經檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色10 min，在日立H-7650透射電子顯微鏡下觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉肉細胞顯微結構變化

寧夏枸杞葉片葉肉細胞分化為柵欄組織和海綿組織。對照組與100、200和300 mmol/L NaCl濃度下的顯微結構相比，上表皮細胞排列緊密，形狀不規(guī)則；柵欄組織呈長柱形，排列緊密(圖版Ⅰ，1)；100 mmol/L NaCl處理下，上表皮細胞排列緊密，彼此嵌合，沒有細胞間隙，形狀不規(guī)則；柵欄組織呈長柱形，排列緊密(圖版Ⅰ，2)；200 mmol/L NaCl處理下，上表皮細胞排列緊密，彼此嵌合，沒有細胞間隙，形狀不規(guī)則，上表皮細胞增厚；柵欄組織呈長柱形，排列緊密(圖版Ⅰ，3)；300 mmol/L NaCl處理下，上表皮細胞排列緊密，彼此嵌合，沒有細胞間隙，形狀不規(guī)則，上表皮細胞增厚；柵欄組織與海綿組織已無明顯區(qū)別，柵欄組織細胞出現縮短現象，形狀由長柱狀變?yōu)槎虉A柱狀，排列疏松且紊亂(圖版Ⅰ，4)。此外，100、200和300 mmol/L NaCl處理與對照組的顯微結構相比，葉綠體數量和線粒體數量無明顯變化(圖版Ⅰ，1-4)。

圖版Ⅰ NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片和幼根顯微結構變化U.上表皮細胞；L.下表皮細胞；P.柵欄組織；S.海綿組織；Ch.葉綠體；Epi.表皮；CO.皮層；EN.內皮層；xy.木質部。1. 0 mmol/L NaCl處理的葉片；2. 100 mmol/L NaCl處理的葉片；3. 200 mmol/L NaCl處理的葉片；4. 300 mmol/L NaCl處理的葉片；5. 0 mmol/L NaCl處理的幼根；6. 100 mmol/L NaCl處理的幼根；7. 200 mmol/L NaCl處理的幼根；8. 300 mmol/L NaCl處理的幼根Plate Ⅰ The microstructure changes of leaves and young roots of L. barbarum under salt stressU. Upper epidermal cells; L. Epidermal cells; P. Palisade tissue; S. Sponge tissue; Ch. Chloroplast; Epi. Epidermis; CO. Cortex; EN. Endodermis; xy. Xylem.1. 0 mmol/L NaCl-treated leaves; 2. 100 mmol/L NaCl-treated leaves; 3. 200 mmol/L NaCl-treated leaves; 4. 300 mmol/L NaCl-treated leaves;5. 0 mmol/L NaCl-treated young roots; 6. 100 mmol/L NaCl treated young roots; 7. 200 mmol/L NaCl treated young roots; 8. 300 mmol/L NaCl treated young roots

2.2 NaCl脅迫下寧夏枸杞幼根細胞顯微結構變化

寧夏枸杞幼根的初生結構由表皮、皮層和維管柱組成，維管柱又分為中柱鞘、初生木質部和初生韌皮部。寧夏枸杞幼根表皮細胞排列整齊而緊密，無細胞間隙。皮層由薄壁細胞組成，在表皮下有一層或幾層細胞，排列緊密，為外皮層，皮層的最內一層細胞為內皮層，內皮層細胞排列整齊、緊密。與對照組相比，100、200和300 mmol/L NaCl處理下，根的初生結構無明顯變化，且結構完整(圖版Ⅰ，5-8)。

2.3 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉肉細胞超微結構變化

在無NaCl處理條件下，寧夏枸杞葉肉細胞中葉綠體形態(tài)飽滿，結構完整，呈橢圓狀，緊貼細胞膜分布成一排，葉綠體膜和類囊體結構清楚，基粒片層清晰可見，排列整齊。線粒體呈比較規(guī)則的球形或橢球形，形態(tài)飽滿，雙層膜結構清晰(圖版Ⅱ，A1-A2)；100 mmol/L NaCl處理下，葉綠體形態(tài)飽滿，結構完整，葉綠體膜和類囊體結構清楚，基粒片層清晰可見，排列整齊。線粒體呈球形或橢球型，大小不一，形態(tài)飽滿，雙層膜結構清晰(圖版Ⅱ，B1-B2)；200 mmol/L NaCl處理下，部分葉綠體內類囊體膜發(fā)生解體，內部的基粒片層減少或膨脹，排列疏松，部分模糊不清，同時雙層膜受到破壞，葉綠體不再緊貼細胞膜，出現大的空泡現象。線粒體形狀發(fā)生改變，大小不一，雙層膜結構清晰(圖版Ⅱ，C1-C2)；300 mmol/L NaCl處理下，葉綠體結構發(fā)生變形，基粒片層排列紊亂，有輕微彎曲，而且破裂出現大的空泡，雙層膜受到破環(huán)。線粒體形狀大小不一，出現極少數空泡現象(圖版Ⅱ，D1-D2)。此外，100，200和300 mmol/L NaCl處理與對照組的葉肉細胞超微結構相比，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多。

圖版Ⅱ NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片超微結構變化CW.細胞壁；Ch.葉綠體；Th.類囊體片層；OG.嗜鋨顆粒；S.淀粉粒；Mi.線粒體。A1-A2. 0 mmol/L NaCl處理的葉片；B1-B2.100 mmol/L NaCl處理的葉片；C1-C2.200 mmol/L NaCl處理的葉片；D1-D2.300 mmol/L NaCl處理的葉片Plate Ⅱ Ultrastructural changes of L. barbarum leaves under NaCl stressCW. Cell wall; Ch. Chloroplast; Th. Thylakoid lamella; OG. Osmiophilic granule; S. Starch grain. Mi. Mitochondrion. A1-A2. 0 mmol/L NaCl-treated leaves; B1-B2.100 mmol/L NaCl-treated leaves; C1-C2. 200 mmol/L NaCl-treated leaves; D1-D2. 300 mmol/L NaCl-treated leaves

2.4 NaCl脅迫下寧夏枸杞幼根細胞超微結構變化

在無NaCl處理的寧夏枸杞幼根皮層薄壁細胞中，細胞核雙層膜清晰可見，核基質豐富。線粒體分布在細胞膜周圍，呈大小不一的橢球形或球形，結構完整，形態(tài)飽滿，內膜上的嵴和雙層膜清晰(圖版Ⅲ，A1-A2)；在100 mmol/L NaCl處理下，細胞核雙層膜清晰，核基質豐富。線粒體分布在細胞膜周圍，呈橢球型，內膜上的嵴和雙層膜清晰(圖版Ⅲ，B1-B2)；在200 mmol/L NaCl處理下，細胞核雙層膜解體，核基質有外溢現象。線粒體呈大小不一的球型，少數結構被破壞，雙層膜較清晰，部分嵴模糊，出現空泡現象(圖版Ⅲ，C1-C2)；在300 mmol/L NaCl處理下，細胞核解體，雙層膜被破壞，核基質大量外溢，線粒體形狀發(fā)生改變，內外膜模糊甚至破裂，大多數嵴模糊，出現空泡現象(圖版Ⅲ，D1-D2)。

圖版Ⅲ NaCl脅迫下寧夏枸杞幼根細胞超微結構變化CW.細胞壁；N.細胞核；Mi.線粒體.A1-A2. 0 mmol/L NaCl處理的幼根；B1-B2.100 mmol/L NaCl處理的幼根；C1-C2.200 mmol/L NaCl處理的幼根；D1-D2.300 mmol/L NaCl處理的幼根Plate Ⅲ Ultrastructural changes of young roots cells of L. barbarum under NaCl stressCW. Cell wall; N. Nucleus; Mi. Mitochondrion. A1-A2. 0 mmol/L NaCl-treated young roots; B1-B2. 100 mmol/L NaCl-treated young roots; C1-C2. 200 mmol/L NaCl-treated young roots; D1-D2. 300 mmol/L NaCl-treated young roots

3 討 論

鹽堿作為一種主要的逆境，對植物的生長發(fā)育具有顯著影響，如生長受到抑制，葉綠素含量減少，脯氨酸含量增加，葉綠體和線粒體內部結構破壞等[14-16]。本研究結果表明，不同濃度的NaCl脅迫對寧夏枸杞葉片和幼根細胞的顯微及超微結構影響不同，NaCl濃度大于200 mmol/L時，寧夏枸杞葉片和幼根細胞的超微結構發(fā)生了明顯變化。

3.1 NaCl脅迫對寧夏枸杞葉片葉肉細胞結構的影響

不同鹽濃度下，鹽角草和鹽爪爪等植物的葉肉質化，表皮細胞角質層增厚[17]。隨著鹽濃度的增加，木欖葉的上(下)角質層和上(下)表皮層逐漸增厚[18]。此外，葉肉細胞中柵欄組織縱向伸長可增加葉片對光能的捕獲機會，從而適應鹽脅迫環(huán)境[19]。在鹽脅迫下，竹柳的柵欄組織厚度和角質層厚度在低鹽濃度下其各值均呈現出最大值，隨著鹽濃度上升，其葉片柵欄組織排列較疏松且細胞長度變短[20]。在本研究中，無NaCl處理時，寧夏枸杞柵欄組織排列緊密且整齊，但隨著NaCl濃度的增加，上表皮細胞增厚，柵欄組織出現縮短現象，由長柱狀變?yōu)槎虉A柱狀，排列疏松且紊亂，這與毛桂蓮等[13]的研究結果基本一致，說明NaCl脅迫對寧夏枸杞葉的表皮和細胞柵欄組織產生了顯著影響，且NaCl和NaHCO3脅迫都會引起柵欄組織緊密度降低的現象。

葉綠體作為植物光合作用的場所，完整的葉綠體結構是植物進行正常光合作用的前提，葉綠體的基粒片層數越多，排列越緊密，光合能力越強[21]。如果受到鹽脅迫傷害，葉綠體的基粒片層破壞解體甚至消失時，會抑制光合作用的正常進行[22]，如鹽脅迫下刺槐苗葉片中葉綠體排列和類囊體片層松散，形態(tài)腫大，導致葉片光合作用受到抑制[23]。在本研究中，100 mmol/L NaCl處理時葉綠體與對照組相差不大，葉綠體形態(tài)飽滿，結構完整，呈橢圓狀，基粒片層清晰可見，排列整齊，淀粉粒增多。但在200和300 mmol/L NaCl處理時，葉綠體內類囊體膜發(fā)生解體，基粒片層數目減少或膨脹，排列疏松，同時雙層膜受到破壞，出現大的空泡現象，淀粉粒增多。這表明低濃度NaCl脅迫對寧夏枸杞葉片沒有明顯影響，而高濃度NaCl脅迫對寧夏枸杞葉片細胞葉綠體基粒片層具有損傷作用，可能會導致葉片光合作用受到抑制，光合能力下降。此外，高濃度NaCl脅迫下淀粉粒增多可能是因為淀粉粒作為重要的光合產物，可以水解釋放能量，補充因脅迫造成的能量損失，這為寧夏枸杞具有較強耐鹽堿性提供了結構方面的依據。此外，本研究發(fā)現隨著鹽脅迫濃度的加劇，葉肉細胞中線粒體的變化沒有葉綠體的變化顯著，這說明葉肉細胞中線粒體在鹽脅迫環(huán)境下的受損較晚于葉綠體，這可能與葉片的呼吸作用有關，因為葉片受到脅迫后仍需要線粒體提供能量來轉移營養(yǎng)物質[24]。因此，推測葉肉細胞中線粒體的耐鹽性比葉綠體強。

3.2 NaCl脅迫對寧夏枸杞幼根細胞結構的影響

脅迫條件會破壞細胞的結構，最終會導致細胞生理功能減弱甚至喪失，是植物遭受逆境脅迫的機制之一[25-26]。在鹽脅迫下，植物根的組織和細胞結構發(fā)生變化，且細胞中線粒體和細胞核的形態(tài)、結構、大小、數目及其分布也常因環(huán)境條件的變化而發(fā)生相應改變[27-28]，如鹽脅迫下棉花的根內皮層凱氏帶長度增加[29]。隨著鹽濃度的增加，小花堿茅根內皮層細胞壁明顯增厚，且增厚的內皮層細胞壁在高濃度鹽分下可以明顯地幫助植物阻礙鹽離子的進入[30]。Hans等[31]研究發(fā)現, 鹽處理使高粱根內皮層細胞壁加厚, 導致根表皮細胞和皮層細胞線粒體的數量增加。正常情況下，棉花根系細胞中線粒體結構完整，膜清晰可見，但鹽脅迫下，線粒體數量增多，膜系統(tǒng)受到破壞，內膜上的嵴減少甚至模糊[32]。在本研究中，100 mmol/L NaCl脅迫對寧夏枸杞幼根皮層薄壁細胞中線粒體沒有明顯影響，但隨著NaCl脅迫的加重，線粒體形狀發(fā)生改變，結構破壞，內外膜模糊甚至破裂，大多數嵴模糊，出現空泡現象，這表明高濃度NaCl脅迫導致線粒體內膜被損傷，氧化磷酸化體系被破壞，進而導致根細胞正常生理代謝受阻，而這種形態(tài)的改變可能是寧夏枸杞響應鹽脅迫的重要生理反應之一。

細胞核作為遺傳物質存在的主要部位，是細胞遺傳和代謝活動的控制中心。逆境條件下，細胞核會發(fā)生相應的變化[33]。秦紅艷等[34]發(fā)現鹽處理下細胞核核膜解體或消失。而中度鹽脅迫下，星星草中細胞核染色質高度凝縮，隨著鹽脅迫的加重，細胞核解體[35]。在本研究中，100 mmol/L NaCl脅迫下，細胞核核膜清晰，核基質豐富，但在200、300 mmol/L NaCl脅迫下，細胞核雙層膜被破壞，核基質外溢，細胞核解體。因此，高濃度NaCl脅迫可能導致寧夏枸杞幼根皮層薄壁細胞核膜異?；蚴軗p，核內物質得不到正常的保護，細胞核的功能受到影響，從而影響到整個根系細胞的代謝活動。

綜上所述，100 mmol/L NaCl脅迫對寧夏枸杞葉片和幼根的結構沒有明顯的影響，但高濃度NaCl脅迫可導致寧夏枸杞葉片和幼根細胞顯微和超微結構發(fā)生明顯變化，且隨著NaCl濃度的增加，變化越明顯。