陳 陽，郭占斌，武 悅，張 春，韓鳳霞，單飛彪

(1 巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究所, 內(nèi)蒙古臨河 015000；2 內(nèi)蒙古益稷生物科技有限公司,呼和浩特 010050；3 巴彥淖爾市現(xiàn)代農(nóng)牧事業(yè)發(fā)展中心, 內(nèi)蒙古臨河 015000)

脅迫相關(guān)蛋白(stress associated protein, SAP)是一類具有A20/AN1結(jié)構(gòu)特征的鋅指蛋白，廣泛存在于真核生物中。植物SAP是一個(gè)多基因家族，不同物種SAP家族基因數(shù)目不等。擬南芥、水稻[1]、番茄[2]、棉花[3]、蘋果[4]和黃瓜[5]等物種中分別鑒定出14、18、13、37、30和12個(gè)SAP家族基因。2004年水稻OsiSAP1是植物中首個(gè)被報(bào)道的SAP家族基因，該基因受干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且正向調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物的抗性[6]。近年來，隨著不同物種中SAP家族基因陸續(xù)被克隆和功能分析，其機(jī)理主要包括3個(gè)角色，即泛素連接酶[7]、氧化還原感受器[8-9]和基因表達(dá)調(diào)控因子[10]。

植物SAP具有多種生物功能，主要參與非生物脅迫的響應(yīng)。多種非生物脅迫可以快速誘導(dǎo)植物SAP基因的表達(dá)，例如擬南芥AtSAP9在NaCl脅迫和甘露醇模擬的滲透脅迫處理1 h的表達(dá)量均顯著增加，且分別在1 h和3 h達(dá)到最大值[11]。香蕉MaSAP1在NaCl和冷處理6 h的表達(dá)量增加到最大值，在PEG-6000干旱脅迫12 h表達(dá)量達(dá)到最高值[12]。大豆基因組中共鑒定出27個(gè)SAP基因，其中13個(gè)SAP基因在干旱處理1 h表達(dá)量顯著上調(diào)，14個(gè)SAP基因在鹽脅迫2 h的表達(dá)量增加顯著[13]。SAP基因的過表達(dá)可以顯著提高受體的非生物脅迫抗性。MusaSAP1[14]、香雪球LmSAP[9]、蘋果MdSAP15[4]、楊樹PtSAP13[15]等基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗性，包括干旱、高鹽、重金屬等非生物脅迫。另外，SAP家族基因還參與植物的生長發(fā)育。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)青蒿AaSAP1可以正向調(diào)控腺毛的發(fā)育，從而有效提高青蒿素的產(chǎn)量。小麥TaSAP7-B啟動子包含一個(gè)dCAPS標(biāo)記SNP-260，該標(biāo)記與小麥植株重量、花序梗長度、倒數(shù)第二節(jié)間長度、株穗數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)，為以后分子標(biāo)記輔助選擇小麥優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)[17]。

藜麥營養(yǎng)豐富且全面，含有多酚、皂苷、黃酮等特殊化學(xué)成分，近年來作為一種新興的保健型食品越來越受到消費(fèi)者的青睞[18]。藜麥具有較高的非生物脅迫抗性，適應(yīng)性強(qiáng)，在中國多個(gè)省份均有種植[19-20]。近年來，關(guān)于藜麥的研究主要集中在表型和生理生化方面[21-22]。隨著藜麥高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù)的公布，藜麥功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的研究得到極大促進(jìn)。迄今為止，尚未有藜麥SAP家族基因克隆和脅迫應(yīng)答方面的報(bào)道。本研究從藜麥中克隆脅迫相關(guān)蛋白基因CqSAP8，分析其編碼的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)特征，通過序列比對和構(gòu)建進(jìn)化樹分析CqSAP8的親緣關(guān)系，利用qRT-PCR技術(shù)分析該基因的組織特異性以及在干旱、鹽脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究CqSAP8基因功能和信號傳導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為藜麥19M2，由內(nèi)蒙古益稷生物科技有限公司提供。參照時(shí)丕彪等[23]的方法對藜麥進(jìn)行水培種植，六葉期對幼苗分別進(jìn)行20% PEG-6000、200 mmol/L NaCl、42 ℃高溫、4 ℃低溫和100 μmol/L ABA處理，分別在處理0、1、3、6、12和24 h剪取葉片，迅速置于液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄利用RNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取藜麥總RNA，利用TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2 藜麥CqSAP8的克隆根據(jù)GenBank上公布的藜麥基因CqSAP8(登錄號XM_021916348)序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(表1)，以干旱脅迫處理0 h樣品cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為58 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，構(gòu)建到pEASY-Blunt Cloning Vector載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑取陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物信息

1.2.3 生物信息學(xué)分析利用在線軟件ProtParam tool(https://web.expasy. org/protparam/)分析CqSAP8蛋白的理化性質(zhì)，利用ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)分析CqSAP8蛋白質(zhì)的親/疏水性；分別用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)網(wǎng)站分析CqSAP8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對；利用MEGA 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 藜麥CqSAP8基因表達(dá)分析根據(jù)藜麥CqSAP8基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物(表1)，以EF1α為內(nèi)參基因，使用Roche Lightcycler 96進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系20 μL(參照TaKaRa TB Green Fast qPCR Mix試劑盒)，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算藜麥CqSAP8基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqSAP8基因的克隆

以藜麥幼苗葉片cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得781 bp的擴(kuò)增條帶(圖1)?；厥諗U(kuò)增條帶并連接到pEASY-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明CqSAP8基因CDS全長528 bp，編碼175個(gè)氨基酸。

M. DL2000；1. CqSAP8圖1 CqSAP8的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of CqSAP8

2.2 CqSAP8蛋白序列與理化性質(zhì)分析

Expasy分析表明CqSAP8蛋白分子式為C802H1299N229O258S14，相對分子質(zhì)量為18.73 kD，理論等電點(diǎn)為7.46。CqSAP8蛋白由19種氨基酸構(gòu)成(圖2)，其中賴氨酸數(shù)目最多，共計(jì)16個(gè)(9.1%)，其次是丙氨酸和纈氨酸，分別為15個(gè)(8.6%)和14個(gè)(8.0%)，組氨酸、蛋氨酸和酪氨酸數(shù)目最少，均為3個(gè)(1.7%)。CqSAP8蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為38.14。利用ProtScale分析CqSAP8蛋白質(zhì)的親/疏水性(圖3)，最大值和最小值分別位于第75位的蘇氨酸(+1.700)和第143位的絲氨酸(-2.733)，親水性平均系數(shù)為-0.357。以上結(jié)果說明CqSAP8屬于穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。

圖2 CqSAP8基因的ORF序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The ORF sequence and the deduced amino acid sequence of CqSAP8 gene

圖3 CqSAP8親疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity analysis of CqSAP8

2.3 CqSAP8蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI網(wǎng)站上的CD Search搜索CqSAP8的保守域(圖4，A)，發(fā)現(xiàn)位于N端第16至39位的zf-A20保守域和C端第116至153位的ZnF_AN1保守域，說明CqSAP8屬于典型的SAP家族成員。利用SOPMA預(yù)測CqSAP8蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖4，B)，結(jié)果顯示CqSAP8蛋白包含4種結(jié)構(gòu)，即由56個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的α螺旋、5個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的β轉(zhuǎn)角、16個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈和98個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的無規(guī)則卷曲。

A.CqSAP8蛋白的保守域分析; B. CqSAP8蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)：藍(lán)色.α螺旋；紅色.延伸鏈；紫色.無規(guī)則卷曲；綠色.β轉(zhuǎn)角圖4 CqSAP8蛋白的結(jié)構(gòu)分析A. Analysis of CqSAP8 conserved domain; B. Secondary structure of CqSAP8 protein: Blue. Alpha helix; Red. Extended strand; Purple. Random coil； Green. Beta turnFig.4 The structure analysis of CqSAP8 protein

2.4 CqSAP8蛋白的同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫通過同源比對獲得水稻OsSAP8(Oryzasativa，XP_015643189.1)、苜蓿MtSAP8(Medicagotruncatula，XP_024632562.1)、煙草NtSAP8(Nicotianatabacum， XP_016464057.1)等SAP8蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)不同物種SAP8蛋白均含有保守的zf-A20和ZnF_AN1結(jié)構(gòu)域(圖5)。序列比對發(fā)現(xiàn)，藜麥CqSAP8與甜菜BvSAP8、菠菜SoSAP8序列一致性最高，分別達(dá)到了89.66%和89.47%，與谷子SiSAP8序列一致性最低(60.23%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明(圖6)，不同物種SAP8蛋白根據(jù)雙子葉植物和單子葉植物聚類分為2組，其中藜麥CqSAP8與同屬藜科的菠菜SoSAP8、甜菜BvSAP8分布在同一分支，親緣關(guān)系較近。

*和▽分別代表zf-A20和ZnF_AN1結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸圖5 藜麥CqSAP8與其他物種SAP8蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對分析* and ▽ represent the conserved amino acid of zf-A20 and ZnF_AN1, respectivelyFig.5 Amino acid sequence alignment of Chenopodium quinoa CqSAP8 with SAP8 proteins from other species

圖6 CqSAP8與其他植物SAP家族成員的進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis between CqSAP8 and SAP family members of other plants

2.5 CqSAP8基因的組織特異性表達(dá)分析

qRT-PCR分析表明(圖7)，藜麥CqSAP8基因在根、莖、葉、花和種子中均有表達(dá)，但存在顯著的組織特異性，在種子中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，其次是葉、花和根，在莖中表達(dá)量最低。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖7 CqSAP8的組織表達(dá)特性分析Different letters indicate significant differences (P<0.05)Fig.7 The expression characteristics of CqSAP8 in tissues

2.6 CqSAP8基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)特性

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖8)，PEG脅迫處理1 h后，藜麥CqSAP8基因的表達(dá)量開始顯著增加，12 h達(dá)到最大值，為對照的13.09倍，24 h表達(dá)量略微下降，但不顯著。CqSAP8基因受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在處理3 h達(dá)到一個(gè)小高峰，隨后表達(dá)量有所降低，在12 h達(dá)到最大值，是未處理時(shí)的3.5倍。高溫和低溫處理均能誘導(dǎo)CqSAP8不同程度地上調(diào)表達(dá)，分別在12和6 h達(dá)到最大峰值，分別為對照的17.47和3.91倍。以上結(jié)果表明，CqSAP8基因響應(yīng)多種非生物脅迫應(yīng)答。另外，為了解CqSAP8基因?qū)Χ喾N非生物脅迫的響應(yīng)是否依賴于ABA，采用100 mmol/L ABA對藜麥幼苗進(jìn)行處理， 3 h內(nèi)CqSAP8表達(dá)量增加不顯著，6和12 h的表達(dá)量分別是對照的5.10和6.22倍，24 h的表達(dá)量急劇升高，達(dá)到對照的53.62倍。

不同小寫字母表示同一脅迫不同時(shí)間差異顯著(P<0.05)圖8 CqSAP8在不同非生物脅迫下的相對表達(dá)Different letters indicate significant differences with same stress under different stress time (P<0.05)Fig.8 Relative expression of CqSAP8 under different abiotic stresses

3 討 論

SAP是鋅指蛋白家族中的一類蛋白，其特點(diǎn)是具有A20結(jié)構(gòu)域和(或)AN1結(jié)構(gòu)域，A20鋅指結(jié)構(gòu)域含有CX2-4CX11CX2C保守序列[24]，AN1鋅指結(jié)構(gòu)域包含CX2CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC和CX4CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC兩種類型的保守序列[25]。大多數(shù)SAP蛋白同時(shí)具有A20結(jié)構(gòu)域和AN1結(jié)構(gòu)域。本研究從藜麥克隆CqSAP8基因，其編碼蛋白含有1個(gè)位于N段的A20保守域和1個(gè)位于C段的AN1保守域，屬于典型的SAP蛋白組合類型。CqSAP8蛋白的AN1結(jié)構(gòu)域的保守序列屬于CX2CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC類型，與AtSAP5的AN1結(jié)構(gòu)域類型一致。Kang等[7]發(fā)現(xiàn)AtSAP5具有泛素連接酶活性，而且其活性依賴C端的AN1結(jié)構(gòu)域。CqSAP8是否具有泛素連接酶活性，以及其活性是否依賴AN1結(jié)構(gòu)域，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證，為后續(xù)研究CqSAP8功能提供方向。

CqSAP8基因堿基數(shù)目較少，全長528 bp，編碼175個(gè)氨基酸，無內(nèi)含子。不同植物中SAP家族成員不含內(nèi)含子或內(nèi)含子數(shù)目較少。例如蘋果基因組中含有30個(gè)SAP基因，其中25個(gè)無內(nèi)含子，5個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子[4]。Zhang等[13]鑒定出27個(gè)大豆SAP基因，不含內(nèi)含子和含有一個(gè)內(nèi)含子的基因數(shù)目分別為18個(gè)和9個(gè)。研究表明，無內(nèi)含子或內(nèi)含子少的基因在轉(zhuǎn)錄過程中可以減少RNA修飾，從而快速表達(dá)[26-27]。在PEG和NaCl脅迫下，藜麥CqSAP8基因均在1 h的表達(dá)增加量達(dá)到極顯著。以上結(jié)果說明藜麥CqSAP8由于基因片段小，且不含內(nèi)含子，基因的表達(dá)快速響應(yīng)干旱和鹽脅迫。

已有研究表明，植物SAP是一類參與非生物脅迫應(yīng)答和調(diào)控的鋅指蛋白，屬于植物逆境信號傳導(dǎo)途徑中的上游調(diào)控因子，通過正向或負(fù)向調(diào)控下游功能基因的表達(dá)，影響植物的抗逆性[28]。擬南芥AtSAP5的表達(dá)量在高鹽、干旱和凍害等脅迫下不同程度地上調(diào)表達(dá)，35S∷AtSAP5轉(zhuǎn)基因株系中干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)量增加，抗旱性提高[7]。本研究發(fā)現(xiàn)CqSAP8基因受干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，說明CqSAP8基因參與多種非生物脅迫的響應(yīng)。CqSAP8基因均在干旱和高溫脅迫的12 h表達(dá)量達(dá)到最大值，分別是對照的13.09和17.47倍，而高鹽和低溫脅迫下的最大表達(dá)量均為對照的3.91倍，推測CqSAP8基因在調(diào)控藜麥干旱和高溫脅迫方面發(fā)揮更重要的作用。CqSAP8在ABA脅迫下3 h內(nèi)的表達(dá)量增加不顯著，24 h急劇升高，說明CqSAP8在非生物脅迫前期的響應(yīng)不依賴ABA。藜麥CqSAP8基因在非生物脅迫下的調(diào)控機(jī)理及功能仍需要深入研究，后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因和基因編輯手段分析下游調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)，觀察植株在非生物脅迫下的抗性表現(xiàn)，從而揭示藜麥CqSAP8基因的作用機(jī)理。