李 彤，邵慧慧，韓嘉寧，王雪蓮，胡增輝，吳 靜*

(1 北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206；2 北京林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 102206)

花香不僅是植物重要的觀(guān)賞特性，也是植物體內(nèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)植物的防御和繁衍有重要意義。光照作為重要的環(huán)境因子，對(duì)花香成分的合成和釋放起著調(diào)控作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，‘金盞銀臺(tái)’水仙花香中的化合物數(shù)量隨著光強(qiáng)的增加表現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律，在低光強(qiáng)下花香成分更多，而花香中不同化合物種類(lèi)的相對(duì)含量隨光強(qiáng)則表現(xiàn)不同的變化規(guī)律[2]。黑暗條件下桂花清香、甜香氣息不足可能是持續(xù)黑暗導(dǎo)致芳樟醇及其氧化物、反式-β-羅勒烯等萜烯類(lèi)物質(zhì)釋放比例降低的原因[3]；梔子的香氣成分種類(lèi)隨著遮光率的增加而減少，其中萜烯類(lèi)物質(zhì)隨著遮光率的增加先增加后減少[4]；藍(lán)光也能夠促進(jìn)萜烯類(lèi)揮發(fā)物的合成和釋放，茶葉中的揮發(fā)性萜烯在藍(lán)光照射下顯著增加，藍(lán)光處理下墨西哥薄荷精油主要成分倍半萜的合成途徑也更加活躍[5-6]。但是光調(diào)控花香揮發(fā)性物質(zhì)合成和釋放的機(jī)制及信號(hào)途徑尚不清楚。

PIFs(phytochrome-interacting factors)是一種bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，作為光形態(tài)建成的負(fù)調(diào)控因子[7]，主要響應(yīng)溫度及紅光信號(hào)。PIF4是高溫條件下促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，PIF5在高溫誘導(dǎo)的適應(yīng)機(jī)制中也有一定作用[8]。PIFs與(遠(yuǎn))紅光受體PHYA/B(Phytochromes A/B)形成的模塊具有多種調(diào)控功能，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥表皮可通過(guò)phyB-PIF4-生長(zhǎng)素途徑控制植株心皮和氣孔發(fā)育等[9]； PIFs也可與藍(lán)光受體光敏色素CRYs(cryptochromes)相互作用調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄過(guò)程，PIF4被證明可與CRY1、CRY2相互作用以調(diào)節(jié)植物蔭蔽反應(yīng)，調(diào)控?cái)M南芥下胚軸伸長(zhǎng)[10-11]。而且PIFs在植物的次生代謝調(diào)控中也發(fā)揮重要的作用，MEP(methylerythritol phosphate)和MVA(mevalonate)是植物萜烯合成的兩條關(guān)鍵途徑[12]。研究表明PIF5可對(duì)萜烯的生物合成進(jìn)行調(diào)控[13]，在pif1、pif3、pif4、pif5單突變體和pifQ突變體中，DXS1、DXR、HDR基因表達(dá)水平顯著升高，提示PIFs是負(fù)調(diào)控因子，ChIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)了PIFs對(duì)DXS1和DXR的直接調(diào)控[14]。在更早的研究中發(fā)現(xiàn)PIFs可能是通過(guò)直接結(jié)合DXS、DXR、HDS、HDR啟動(dòng)子的PBE-BOX原件來(lái)參與MEP途徑的調(diào)控[15]。

金魚(yú)草 (AntirrhinummajusL.)是玄參科金魚(yú)草屬多年生草本植物，因其花色艷麗、品種豐富、生長(zhǎng)周期短而成為研究花卉的模式植物[16]。金魚(yú)草花香的主要物質(zhì)有萜烯物質(zhì)月桂烯、羅勒烯和苯甲酸甲酯等苯環(huán)型/苯丙素類(lèi)物質(zhì)[17]。課題組前期工作表明，用不同光強(qiáng)、光質(zhì)處理金魚(yú)草花朵會(huì)使其花香釋放量差異變化，基于PIF4對(duì)光信號(hào)的響應(yīng)以及對(duì)萜烯合成途徑的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)以‘馬里蘭’金魚(yú)草為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用病毒誘導(dǎo)基因沉默 (virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)，將AmPIF4基因編碼區(qū)片段構(gòu)入煙草脆裂病毒載體獲得重組DNA，侵染金魚(yú)草并測(cè)定基因表達(dá)量；煙草是外源基因瞬時(shí)表達(dá)的首選植物，目前已在多個(gè)方面優(yōu)化條件，煙草葉片能瞬時(shí)表達(dá) GFP[18]，從而檢測(cè)蛋白在細(xì)胞中的定位；以自動(dòng)熱吸附氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(automatic thermal desorption gaschromatography/mass spectrome，ATD-GC/MS)檢測(cè)金魚(yú)草主要花香物質(zhì)的變化，為后續(xù)研究金魚(yú)草花香代謝的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

‘馬里蘭’金魚(yú)草的栽培與養(yǎng)護(hù)方法同韓嘉寧等[19]，本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由本實(shí)驗(yàn)室收集并常溫保存。實(shí)驗(yàn)所用pNC-Green-SubC、pNC-GFP、pTRV載體均為北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有保存材料，pclone007 Blunt Simple載體和大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)DH5α購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司，農(nóng)桿菌GV3101菌株購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1AmPIF4基因片段克隆金魚(yú)草RNA提取、cDNA合成及反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR檢測(cè)方法及反應(yīng)體系同韓嘉寧等[19]。在金魚(yú)草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.sibs.ac.Cn/Am/download-v2.php)內(nèi)查找AmPIF4基因序列(登錄號(hào)Am03g17770)，選取AmPIF4基因編碼區(qū)為目標(biāo)片段，用Snapgene設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的同源臂引物pTRV2-AmPIF4-F和pTRV2-AmPIF4-R(表1)，以cDNA為模板進(jìn)行克隆，擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃ 10 s；56 ℃ 15 s；72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸3 min。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證并純化回收PCR產(chǎn)物。

表1 引物序列

1.2.2AmPIF4基因表達(dá)分析AmPIF4基因時(shí)空表達(dá)分析：(1)采集花蕾期、初開(kāi)期、半開(kāi)期和盛開(kāi)期4個(gè)時(shí)期的花朵，以AmUBI(ubiquitin)為內(nèi)參基因進(jìn)行定量分析，引物見(jiàn)表1；(2)采集金魚(yú)草植株不同器官及組織樣品[根、莖、葉、萼片、子房、花藥、花絲、雌蕊、上瓣與下瓣(將金魚(yú)草花瓣三瓣部分定義為上瓣，兩瓣部分為下瓣)、花筒]，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)；侵染后AmPIF4基因表達(dá)分析:提取侵染后金魚(yú)草花瓣上下瓣混樣作為樣品，方法同上。

1.2.3 侵染后金魚(yú)草花香成分測(cè)定植株在培養(yǎng)間生長(zhǎng) 7 d，觀(guān)察表型變化即花瓣周邊有卷曲、質(zhì)感變硬，但生長(zhǎng)狀態(tài)良好。為了不損傷植物，采用頂空套袋方法收集花香揮發(fā)物，GC-MS 分析花香，具體步驟同趙靜等[17]的實(shí)驗(yàn)方法。

1.2.4AmPIF4基因生物信息學(xué)分析在NCBI上使用blast對(duì)AmPIF4基因序列全長(zhǎng)進(jìn)行同源檢索，下載相似性較高的物種蛋白序列，使用DNAMAN和MAGA7對(duì)序列進(jìn)行同源比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析；使用ExPASy分析蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，并使用 SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 AmPIF4亞細(xì)胞定位及pNC-Green-SubC-AmPIF4重組載體構(gòu)建通過(guò)網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測(cè)AmPIF4定位在細(xì)胞核。根據(jù)AmPIF4 的CDS序列設(shè)計(jì)去終止子引物Z-AmPIF4-F和Z-AmPIF4-R，即反向引物中不包含終止密碼子?？寺〔⒒厥誔CR產(chǎn)物，連接pclone007后轉(zhuǎn)入DH5α，經(jīng)鑒定后提取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到去除終止子的質(zhì)粒。使用帶有通用接頭的引物JT-AmPIF4-F和JT-AmPIF4-R進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)使用SfiI (TaKaRa公司)1 μL,Cut Smart Buffer 5 μL, pNC-Green-SubC 載體3 μL，補(bǔ)充無(wú)菌水至20 μL，50 ℃條件酶切 1.5 h。

使用回收擴(kuò)增產(chǎn)物0.75 μL和酶切產(chǎn)物1.75 μL，2×Seaming Less Mix (TaKaRa公司)無(wú)縫連接酶預(yù)混液2.5 μL，50 ℃條件連接15 min后轉(zhuǎn)入DH5α，涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的平板37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落經(jīng)PCR鑒定提取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，顯示成功構(gòu)建pNC-Green-SubC-AmPIF4重組載體。使用pNC-GFP空載體作為陰性對(duì)照。

1.2.6 病毒重組載體pTRV2-AmPIF4的構(gòu)建對(duì)pTRV2載體進(jìn)行酶切，酶切及連接體系同上。pTRV載體構(gòu)建如圖1所示。

35S．35S啟動(dòng)子；CP.外殼蛋白； Rz．自裂核酶；NOSt. 硝酸鉀合酶終止子圖1 pTRV2-AmPIF4重組載體示意圖35S. 35S promoter; CP. Coat protein; Rz. Self-cleaving ribozyme; NOSt. Nopaline synt hase terminatorFig.1 Schematic diagram of the recombinant vector pTRV2-AmPIF4

1.2.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與侵染將pTRV2-AmPIF4與pTRV質(zhì)粒采用凍融法分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)與利福平(100 μg/mL)的平板，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～96 h。挑取單菌落于相應(yīng)抗性及濃度的LB培養(yǎng)基25 mL，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～24 h。6 000 r/min集菌5 min后加入侵染液(含10 mol/L MgCl2、MES，200 μL/L AS)振蕩懸浮菌體，調(diào)整菌液OD600為1.0左右。將含有pTRV2-AmPIF4、pTRV2與pTRV1的侵染液以1∶1比例混合，黑暗3 h。用一次性注射器對(duì)金魚(yú)草花瓣、莖、葉進(jìn)行注射。

pNC-Green-SubC-AmPIF4和pNC-GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方式同上，菌液OD600為0.8，通過(guò)注射煙草葉片背部進(jìn)行侵染。侵染后的植株在21 ℃、濕度30%培養(yǎng)間黑暗放置12 h后，進(jìn)行16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)7 d。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的實(shí)驗(yàn)材料，從不同植株采集混樣，均進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以SPSS22.0 one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmPIF4基因的克隆與分析

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)顯示，在約1 500 bp附近出現(xiàn)明亮的條帶，條帶清晰且單一，純化回收目的條帶，測(cè)序結(jié)果表明成功克隆AmPIF4基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)，可用于構(gòu)建pTRV2-AmPIF4重組載體。

圖2 AmPIF4基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR detection result of AmPIF4 gene

AmPIF4基因CDS全長(zhǎng)1 498 bp，由498個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)其編碼產(chǎn)物分子量為55.58 kD，等電點(diǎn)為6.44，呈弱酸性。20種氨基酸參與該蛋白的編輯，其中絲氨酸(Ser)含量最高，占11.6%，脯氨酸(Pro)次之，色氨酸(Trp)含量最少，僅有1.2%；AmPIF4包含113個(gè)氨基酸殘基的α-螺旋，占總氨基酸殘基總數(shù)的22.69%；包含24個(gè)氨基酸殘基的延伸鏈，占總氨基酸殘基的4.82%；包含10個(gè)氨基酸殘基的β-折疊，占氨基酸殘基數(shù)的2.01%；包含351個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，占總氨基酸殘基數(shù)的70.48%。

將AmPIF4完整的開(kāi)放閱讀框推測(cè)的氨基酸序列與其他植物進(jìn)行同源檢索(圖3)，該序列與芝麻(Sesamumindicum)、旋蒴苣苔(Dorcocerashygrometricum)的相似性分別達(dá)到58.32%和52.30%。用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，將AmPIF4蛋白與其他18種植物進(jìn)行比對(duì)(圖5)，金魚(yú)草與旋蒴苣苔聚為一類(lèi)，與芝麻、丹參(Salviamiltiorrhiza)親緣關(guān)系較近。

2.2 AmPIF4亞細(xì)胞定位分析

從GFP信號(hào)檢測(cè)可知，對(duì)照pNC-GFP定位于細(xì)胞的整個(gè)原生質(zhì)體(圖4，A)，而pNC-Green-SubC-AmPIF4定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核(圖4，B)，表明AmPIF4特異定位在細(xì)胞核中。

A. pNC-GFP；B. pNC-Green-SubC-AmPIF4圖4 AmPIF4蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of AmPIF4 protein

圖5 AmPIF4蛋白與其他18種植物PIF4蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PIF4 proteins of snapdragon and other 18 plants

2.3 AmPIF4時(shí)空表達(dá)分析

由花朵形態(tài)特征的變化將金魚(yú)草發(fā)育時(shí)期分為4個(gè)階段：花蕾期、初開(kāi)期、半開(kāi)期和盛開(kāi)期(圖6，A)。從花蕾期到盛開(kāi)期，AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，在盛開(kāi)期達(dá)到最高(圖6，B)，花蕾期、初開(kāi)期相對(duì)表達(dá)量相差不大，而相比于半開(kāi)期、盛開(kāi)期達(dá)到顯著差異水平。

A. 金魚(yú)草花朵不同發(fā)育時(shí)期；B. 不同發(fā)育時(shí)期AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)量；C. 盛開(kāi)期金魚(yú)草花朵不同器官及組織中AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 (P<0.05)，下同圖6 AmPIF4基因的表達(dá)A. Different developmental stages of snapdragon flowers；B．Relative expression level of AmPIF4 gene at four flower developmental stages； C．Relative expression of AmPIF4 gene in different organs of fully opened flower and tissues. Different normal letters on the bar represent significant difference (P<0.05), the same as belowFig.6 qRT-PCR qualitative analysis of AmPIF4 gene

盛開(kāi)期花朵不同組織中，萼片中AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是子房、雌蕊，差異均達(dá)顯著水平；上瓣與下瓣次之，且上下瓣AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)量基本一致；金魚(yú)草花朵其他組織中花藥的相對(duì)表達(dá)量最高，花絲次之，而花筒最低，差異顯著。

盛開(kāi)期花朵以外其他器官，即根、莖、葉中AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果表明，葉片中AmPIF4基因的相對(duì)表達(dá)量在盛開(kāi)期金魚(yú)草植株中最高，與莖中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，而與根中差異十分顯著(圖6，C)。

綜上所述，AmPIF4基因在盛開(kāi)期金魚(yú)草植株葉片中相對(duì)表達(dá)量最高，花筒中最低。

2.4 沉默后金魚(yú)草AmPIF4基因表達(dá)分析

由圖7可得，在花瓣中重組病毒載體pTRV2-AmPIF4侵染組的AmPIF4基因相對(duì)表達(dá)量較WT下降65%，較陰性對(duì)照組下降45%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，表明AmPIF4成功被沉默。

WT.野生型；pTRV.陰性對(duì)照；pTRV2-AmPIF4.重組病毒載體圖7 沉默后AmPIF4基因的qRT-PCR結(jié)果WT. Wild type; pTRV. Negative control; pTRV2-AmPIF4. Recombinant virus vectorFig.7 qRT-PCR qualitative analysis of AmPIF4 gene silencing

2.5 AmPIF4的沉默對(duì)金魚(yú)草主要花香成分的影響

以WT野生型組、pTRV陰性對(duì)照組和pTRV2-AmPIF4重組病毒載體組植株為實(shí)驗(yàn)材料，圖8顯示了侵染前后金魚(yú)草釋放的主要花香物質(zhì)中苯甲酸甲酯、月桂烯和羅勒烯的相對(duì)含量。其中，pTRV2-AmPIF4重組病毒載體組植株釋放的羅勒烯和苯甲酸甲酯含量與WT野生型組、pTRV陰性對(duì)照組相比均顯著增加，并以羅勒烯的含量增加尤其顯著。

圖8 金魚(yú)草花瓣中各類(lèi)花香物質(zhì)的含量Fig.8 Relative contents of the floral substance in snapdragon petals

另外，由圖8可得，與陰性對(duì)照相比，沉默AmPIF4后金魚(yú)草花瓣主要花香揮發(fā)物成分月桂烯、羅勒烯和苯甲酸甲酯釋放量分別上升了 22%、24%和12%，花香釋放量總體含量上升。說(shuō)明AmPIF4對(duì)金魚(yú)草主要花香成分的合成釋放存在負(fù)調(diào)控作用。

3 討 論

PIFs轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在多種植物中得到克隆，研究明確MdPIF4在蘋(píng)果溫度響應(yīng)中的作用具有重要意義[20]，GmPIF1在大豆形態(tài)建成中起作用，且促進(jìn)黃酮類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生[21]，ZmPIFs是植物避蔭反應(yīng)的正調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)玉米光信號(hào)和光形態(tài)建成中具有保守和獨(dú)特的分子特性[22]，而PIFs在金魚(yú)草中的作用還未曾報(bào)道。

本研究克隆了金魚(yú)草AmPIF4基因編碼區(qū)序列，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示AmPIF4蛋白定位在細(xì)胞核；檢測(cè)到AmPIF4基因在不同的發(fā)育時(shí)期及各個(gè)組織中均有表達(dá)，金魚(yú)草花香成分主要在花瓣中合成釋放[17]，而不同組織及器官的qPCR結(jié)果顯示AmPIF4在金魚(yú)草植株的葉片、莖等綠色組織及器官中的表達(dá)量高于花瓣，這與MdPIF4在蘋(píng)果葉片中的表達(dá)量最高，其次為根、莖、花，在果實(shí)中的表達(dá)量最低的結(jié)果一致[20]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，PIFs可通過(guò)光信號(hào)傳導(dǎo)參與植物形態(tài)建成，控制植物生長(zhǎng)發(fā)育。擬南芥在受光后，藍(lán)光和紅光激活的光感受器通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子PIFs的活性使下胚軸停止伸長(zhǎng)[23]。同樣，PIFs可以響應(yīng)光及溫度的變化進(jìn)一步影響植物開(kāi)花以及次生代謝等，PIF4轉(zhuǎn)錄因子與植物控制開(kāi)花的基因如ELF、FT等形成復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，研究證明其參與調(diào)控日變溫條件下植物早花[24]，AtPIF4通過(guò)抑制擬南芥AtPAP1的轉(zhuǎn)錄而負(fù)調(diào)控花青素的積累[25]，PIF3也被證明與草莓花青素的積累有關(guān)[26]，PIF4和PIF5調(diào)控?cái)M南芥油菜素內(nèi)酯合成[27]。

目前關(guān)于PIFs轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然集中在逆境應(yīng)答和形態(tài)建成方面[28]，且PIFs對(duì)光信號(hào)響應(yīng)的報(bào)道全部來(lái)自葉片，花瓣中少見(jiàn)。本研究成功地利用同源重組的方法構(gòu)建了pTRV2-AmPIF4載體，使AmPIF4基因在金魚(yú)草植株有效沉默，經(jīng)過(guò)GC-MS花香揮發(fā)物質(zhì)測(cè)定，結(jié)果分析表明，沉默后的金魚(yú)草主要花香物質(zhì)羅勒烯、月桂烯與苯甲酸甲酯含量有不同程度的增加，說(shuō)明AmPIF4對(duì)萜烯類(lèi)花香成分以及苯甲酸甲酯的合成釋放存在負(fù)調(diào)控的作用。

研究為PIF4轉(zhuǎn)錄因子的功能研究提供信息，同時(shí)對(duì)光誘導(dǎo)的花香代謝調(diào)控的研究提供新的思路。植物花香物質(zhì)前體來(lái)自葉片光合產(chǎn)物，而后續(xù)代謝途徑在花瓣中進(jìn)行，PIFs介導(dǎo)的光信號(hào)途徑是否直接調(diào)控萜烯合成途徑與苯丙氨酸代謝途徑仍需進(jìn)一步工作證實(shí)，后續(xù)仍需要對(duì)AmPIF4進(jìn)行生物學(xué)功能、調(diào)控途徑以及作用機(jī)制等方面的研究。